Biomarkers of oxidative DNA damage repair in urine

WPROWADZENIE


Procesy, w wyniku których dochodzi do uszkodzeń DNA, sposoby jego naprawy i konsekwencje wynikające z zaburzeń w naprawie dotyczą całego świata ożywionego. Chociaż istnieją różnice w budowie i organizacji DNA, w budowie i specyficzności działania systemów naprawczych, ich schemat działania w bakteryjnych organizmach jednokomórkowych, komórkach diploidalnych roślin czy w tkankach ludzkich, jest podobny [1]. Walka o zachowanie i utrzymanie integralności genomu trwa nieustannie.
Mutacje nie tylko powodują destrukcję genomu, często były też motorem ewolucji, ułatwiając organizmom przeżycie w zmieniających się warunkach.



Jest powszechnie akceptowane, że uszkodzenia DNA, takie jak oksydacyjnie zmodyfikowane zasady i nukleotydy są przy sprawnych systemach naprawy wycinane i bez dalszych zmian metabolicznych wydzielane do moczu [2, 3, 4, 5]. Wśród wielu możliwych produktów reperacji w moczu zostały zidentyfikowane: 8-oksy-2'-deoksyguanozyna (8-oksydG), 8-oksyguanina (8-oksyGua), glikol tyminy (Tg), glikol tymidyny (dTg), 5-hydroksymetylouracyl (5-OHMU), 5-hydroksyuracyl (5-OHU) i 8-oksyadenina (8-oksyAde) [6, 7, 8, 9, 10, 11].

W aktualnym piśmiennictwie panuje zgodność co do zastosowania oznaczeń 8-oksydG i 8-oksyGua w moczu jako dobrego markera formowania uszkodzeń oksydacyjnych DNA in vivo. Uważa się, że poziom 8-oksy-2'-deoksyguanozyny w moczu jest zdeterminowany naprawą DNA in vivo przez wycinanie nukleotydów (NER) [4, 12]. Drugą możliwością pojawiania się 8-oksydG jest usuwanie oksydacyjnie zmodyfikowanych nukleotydów z ich puli komórkowej. 8-oksy-dGTP jest rozkładane przez 8-oksy-dGTPazę do 8-oksy-dGMP, po czym następuje defosforylacja przy udziale kinazy guanylowej do 8-oksydG i w takiej postaci jest wydzielana do moczu [13]. Przypuszcza się także, że do usunięcia oksydacyjnie zmodyfikowanego nukleozydu guaniny zdolna jest niespecyficzna endonukleaza, która wycina go w postaci 3',5',8-oksy-dGDP, a dalej podobnie jak w przypadku nuleotydów następuje hydroliza do 8-oksydG [13, 14].



Stężenie 8-oksydG w moczu zostało zaproponowane jako nieinwazyjny biomarker uszkodzeń oksydacyjnych DNA [4]. Loft podaje, że wydalanie 8-oksydG przez człowieka zdrowego wynosi 200-600 pmol/kg/24 godz., co odpowiada 168-504 oksydacyjnym modyfikacjom guaniny na dzień dla każdej z 5 x 10¹³ komórki organizmu [4].

Nie można wykluczyć, że 8-oksydG pojawia się w moczu w wyniku degradacji DNA, pochodzącego z martwych komórek, powstałych w wyniku apoptozy czy nekrozy.

Techniką HPLC analizowano również zawartość 8-oksyguaniny (8-oksyGua) w moczu. Stwierdzono, że stężenie tej cząsteczki w moczu jest podobne do zawartości 8-oksydG [7]. Opisano kilka glikozylaz, które w sposób szczególny rozpoznają i usuwają 8-oksyGua z komórek człowieka [15, 16].

Metoda, która byłaby w stanie określić ilość 8-oksydG i 8-oksyGua w tej samej próbce moczu byłaby szczególnie przydatna do poznawania mechanizmów reperacji oksydacyjnych uszkodzeń DNA u człowieka.

Zbadano wpływ różnych czynników, jak wiek, wysiłek fizyczny, palenie tytoniu, płeć, choroby nowotworowe na wydalanie 8-oksydG.



WIEK


Porównawcza analiza zawartości 8-oksydG w moczu ludzi zdrowych z kilku badań wskazuje, że poziom zmodyfikowanego nukleozydu może spadać wraz z wiekiem [12]. Można to tłumaczyć spowolnionym metabolizmem u osób starszych, jak również niewydolnością mechanizmów naprawy [4].
W aktualnym piśmiennictwie brakuje badań, które stwierdzałyby zależność poziomu 8-oksyGua w moczu człowieka od wieku.



METABOLIZM I WYSIŁEK
FIZYCZNY


Zależność między tempem metabolizmu a wydalaniem 8-oksydG została wykazana przez kilku badaczy [3, 17, 18]. Z przeprowadzonych badań wynika, że osoby otyłe wydalają mniej 8-oksydG niż osoby szczupłe. Mężczyźni wydalają ok. 30 proc. więcej 8-oksydG niż kobiety [19].

Ze względu na przyspieszony metabolizm tlenu, wysiłek fizyczny powinien generować oksydacyjne uszkodzenia DNA. Jednak krótkoterminowy wysiłek nie powodował znaczącego wzrostu w moczu 8-oksydG, natomiast 10 godz. po intensywnym wysiłku w warunkach maratonu stwierdzano wzrost w moczu 8-oksydG do 130 proc. stanu wyjściowego w przeliczeniu do poziomu kreatyniny w moczu [20]. Ponadto po okresie 30-dniowych intensywnych ćwiczeń od 8 do 11 godz. dziennie u żołnierzy, poziom 8-oksydG powiększał się znacząco [21].




TYTOŃ


Wpływ palenia tytoniu na podwyższenie zawartości w moczu oksydacyjnie zmodyfikowanego nukleozydu guaniny jest ewidentnie wykazany w licznych doświadczeniach. Stwierdzono, że palacze wydalają dziennie ok. 30 do 50 proc. więcej 8-oksydG [19, 22, 23] i ok. 100 proc. więcej 8-oksyG niż niepalący [7]. Ponadto 4 tyg. po zaprzestaniu palenia, wydalanie 8-oksydG zmniejszało się o 20 proc. u 65 osób poddanych kontrolowanemu badaniu [24].



WPŁYW DIETY


Przeprowadzono badanie, w którym monitorowano poziom tej pochodnej w moczu szczurów podzielonych na 2 grupy. Jedna była karmiona normalnie, a u drugiej zastosowano dietę nie zawierającą kwasów nukleinowych. Okazało się, że poziom zmodyfikowanej zasady 8-oksyGua w moczu szczurów karmionych normalną dietą był o wiele wyższy w porównaniu z wartościami w drugiej grupie. Poziom zmodyfikowanego nukleotydu 8-oksydG w tym przypadku był porównywalny w obu grupach [25].



Inni autorzy po podaniu szczurom dojelitowo znakowanej 8-oksydG oraz dożylnie dG nie stwierdzili w moczu znakowanej 8-oksydG, co sugeruje, że na jej poziom nie wpływa 8-oksydG pochodząca z pokarmu ani oksydacja dG podczas jej wydzielania do moczu [10]. Analiza w moczu 8-oksyGua przedstawiała jak dotychczas szczególne trudności metodyczne [4, 26] i aż do niedawna metody prezentowane przez autorów nie były godne zaufania.
Ostatnio opracowano metodę pozwalającą na oznaczenie w tej samej próbce moczu produktów reperacji DNA 8-oksydG i 8-oksyGua przy wykorzystaniu jednocześnie techniki HPLC i GC/MS [27].

W Katedrze i Zakładzie Biochemii Klinicznej Akademii Medycznej w Bydgoszczy przystosowano do wymogów odczynnikowych i sprzętowych metodę opracowaną przez Ravanata i wsp. Wykorzystując tę technikę przeprowadzono badania mające na celu ocenę wpływu diety na poziomy 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua w moczu człowieka. Dla oceny dokładności pomiarów 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua w dobowej zbiórce moczu (DZM), analizy były powtarzane 7 razy w tych samych próbkach moczu dla każdego z badanych. Ponieważ poprzednie badania [28] sugerowały, że ilość 8-oksyG w moczu szczura osiąga najniższą wartość w drugim lub trzecim dniu diety wolnej od kwasów nukleinowych, próbki moczu (dobowa zbiórka moczu) w tym badaniu zbierane były po trzech dniach stosowania diety wolnej od kwasów nukleinowych i od tych samych osób w trzy do pięciu dni po powrocie do normalnej nieograniczonej diety. Średnie poziomy 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua analizowanych zestawień obu próbek moczu były porównywalne. Postawiono wniosek, że dobowa ilość 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua wydalana z moczem u człowieka nie zależy od diety i może być kompletnym obrazem ilości tych oksydacyjnych pochodnych zasad azotowych pochodzących z komórkowego DNA [29].



CHOROBY NOWOTWOROWE


Porównywano zawartość 8-oksydG w moczu pacjentów chorych na chorobę nowotworową z zawartością tego związku w moczu ludzi zdrowych. Wyniki tych badań pokazuje tab.

Produkty naprawy uszkodzeń materiału genetycznego wydzielane są z moczem [17, 27, 35]. Przydatnym w odpowiedzi na wiele pytań o udziale oksydacyjnych zmian w DNA człowieka, w procesie powstawania nowotworów i zaburzeniach mechanizmów naprawy uszkodzonego DNA, mogłaby być metoda umożliwiająca pomiar ilości utlenionych zasad w DNA w materiale pobieranym w sposób nieinwazyjny. Materiałem klinicznym, który pobiera się od pacjentów w sposób nieinwazyjny jest mocz.



Poziom 8-oksy-dG i 8-oksy-Gua w moczu człowieka powinien odzwierciedlać z jednej strony poziom uszkodzeń oksydacyjnych w DNA i puli nukleotydowej komórek, a z drugiej sprawność mechanizmów naprawy DNA. Jednak prawdziwe relacje oraz różnorodność międzyosobnicza nie są jeszcze przebadane, ponieważ do niedawna nie istniała metoda jednoczesnego oznaczania tych związków w moczu.



Otwierająca się możliwość szacowania sprawności mechanizmów naprawczych w oparciu o analizę moczu jest niesłychanie pociągająca ze względu na całkowitą bezinwazyjność i może umożliwić opracowanie testów służących do indywidualizacji terapii.



PIŚMIENNICTWO

1. Janion C. Mutageneza - uszkodzenia i naprawa DNA. Kosmos 1999; 48 (4): 289-92.
2. Shigenaga MK, Gimeno CJ, Ames BN. Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 86: 9697-701.
3. Loft S, Poulsen HE. Markers of oxidative damage to DNA: antioxidants and molecular damage. Methods in Enzymology 1995; 300: 166-84.
4. Loft S, Poulsen HE. Estimation of oxidative DNA damage in man from urinary excretion of repair products. Acta Biochem Pol 1998; 45: 133-44.
5. Ravanat JL, Guichert P, Tuce Z, Cadet J. Simultaneous determination of five oxidative DNA lesions in human urine. Chem Res Toxicol 1999; 12: 802-8.
6. Loft S, Poulsen HE. Cancer risk and oxidative DNA damage in man [published erratum appears in J Mol Med 1997 Jan; 75 (1): 67-8]. J Mol Med 1996; 74: 297-312.
7. Suzuki J, Inoue Y, Suzuki S. Changes in urinary excretion level of 8-hydroxyguanine by exposure to reactive oxygen-generating substances. Free Radicals Biol Med 1995; 18: 431-6.
8. Teixeira AJ, Ferreira MR, van Dijk WJ, van de Werken G, de Jong AP. Analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat urine and liver DNA by stable isotope dilution gas chromatography/mass spectrometry. Anal Biochem 1995; 226: 307-19.
9. Faure H, Incardona MF, Boujet C, Cadet J, Ducros V, Favier A. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of 5-hydroxymethyluracil in human urine by stable isotope dilution. J Chromatogr 1993; 616: 1-7.
10. Shigenaga MK, Gimeno CJ, Ames BN. Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 86: 9697-701.
11. Cathcart R, Schwiers E, Saul RL, Ames BN. Thymine glycol and thymidine glycol in human and rat urine. A possible assay for oxidative DNA damage. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81: 5633-7.
12. Lunec J, Herbert K, Blount S, Griffiths HR, Emery P. 8-Hydroxydeoxyguanosine. A marker of oxidative DNA damage in systemic lupus erythematosus. FEBS. Lett. 1994; 348: 131-8.
13. Cooke MS, Evans MD, Herbert KE, Lunec J. Urinary 8-Oxo-2'-Deoxyguanosine - Source, Significance and Supplements. Free Rad Res 2000; 32: 381-97.
14. Tudek B. Mechanizmy naprawy utlenionych zasad DNA. Kosmos 1999; 245: 339-52.
15. Radicella JP, Dherin C, Desmaze CH, Fox MS, Boiteux S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Sacharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 8010-15.
16. Hazra TK, Izumi T, Maidt L, Floyd RA, Mitar S. The presence of two distinct 8-oxoguanine repair enzymes in human cells: their potential complementary roles in preventing mutations. Nucleic Acid Res 1998; 26: 5116-22.
17. Loft S, Fischer-Nielsen A, Jeding IB, Vistisen K, Poulsen HE. 8-Hydroxy-deoxyguanosine as a biomarker of oxidative DNA damage. J Toxicol Environ Health 1993; 40: 391-404.
18. Adelman R, Saul RL, Ames BN. Oxidative damage to DNA: Relation to species metabolic rate and life span. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 2706-8.
19. Loft S, Vistisen K, Ewertz M, Tjonneland A, Overvad K, Poulsen HE. Oxidative DNA-damage estimated by 8-hydroxydeoxyguanosine excretion in humans: influence of smoking, gender and body mass index. Carcinogenesis 1992; 13: 2241-7.
20. Alessio HM. Exercise-induced oxidative stress. Med Sci Sports Exerc 1993; 25: 218-24.
21. Poulsen HE, Loft S, Vistisen K. Increased oxidative DNA damage after 30 days of vigorous exercise. J Sport Sci 1995; 14: 343-46.
22. Loft S, Astrup A, Buemann B, Poulsen HE. Oxidative DNA damage correlates with oxygen consumption in humans. FASEB J 1994; 8: 534-37.
23. Tagesson C, Kallberg M, Leanderson P. Determination of urinary 8-hydroxy-deoxyguanosine by coupled-column high-perfomance liquid chromatography with electrochemical detection: A noninvasive assay for in vivo oxidative DNA damage in humans. Toxicol Methods 1992; 1: 242-51.
24. Prieme H, Loft S, Klarlund M, Gronbaek K, Tonnesen P. Poulsen HE. Effect of smoking cessation on oxidative DNA damage estimated by 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxy-guanosine. Carcinogenesis 1998; 19: 347-51.
25. Park E, Shigenaga MK, Degan P, Korn TS, Kitzler JW, Wehr CM, Kolachana P, Ames BN. Assay of excised oxidative DNA lesions: Isolation of 8-oxoguanine and its nukleoside derivatives from biological fluids with a monoclonal antibody column. Proc Natl Acad Sci (USA) 1992; 89: 3375-9.
26. Helbock HJ, Beckman KB, Shigenaga MK, Walter PB, Woodall AA, Yeo HC, Ames BN. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxoguanine. Proceedings of the National Academy of Science USA 1998; 95: 288-93.
27. Ravanat JL, Guichert P, Tuce Z, Cadet J. Simultaneous determination of five oxidative DNA lesions in human urine. Chem Res Toxicol 1999; 12: 802-8.
28. Park E, Shigenaga MK, Degan P, Korn TS, Kitzler JW, Wehr CM, Kolachana P, Ames BN. Assay of excised oxidative DNA lesions: Isolation of 8-oxoguanine and its nukleoside derivatives from biological fluids with a monoclonal antibody column. Proc Natl Acad Sci (USA) 1992; 89: 3375-9.
29. Gackowski D, Różalski R, Roszkowski K, Jawień A, Foksiński M, Oliński R. 8-Oxoguanine and 8-oxo-2'-deoxyguanosine levels in human urine do not depend on diet. Free Radicals Res 2001; 35: 825-32.
30. Cao EH, Wang JJ. Oxidative damage to DNA: Levels of thymine glycol and thymidine glycol in neoplastic human urines. Carcinogenesis 1993; 14: 1359-62.
31. Bergtold DS, Berg CD, Simic MG. Urinary biomarkers in radiation therapy of cancer. Adv Exp Med Biol 1990; 264: 311-16.
32. Faure H, Coudray C, Mousseau M, Ducros V, Douki T, Bianchini F, Cadet J, Favier A. 5-Hydroxymethyluracil excretion, plasma TBARS and plasma antioxidant vitamins in adriamycin-treated patients. Free Radicals Biol Med 1996; 20: 979-83.
33. Tagesson C, Kallberg M, Leanderson P. Determination of urinary 8-hydroxy-deoxyguanosine by coupled-column high-perfomance liquid chromatography with electrochemical detection: A noninvasive assay for in vivo oxidative DNA damage in humans. Toxicol Methods 1992; 1: 242-51.
34. Tagesson C, Kallberg M, Klintenberg C, Starkhammar H. Determination of urinary 8-hydroxydeoxyguanosine by automated coupled-column high performance liquid chromatography: A powerful technique for assaying in vivo oxidative DNA damage in cancer patients. Eur J Cancer 1995; 31A: 934-40.
35. Cooke MS, Evans MD, Herbert KE, Lunec J. Urinary 8-Oxo-2'-Deoxyguanosine - Source, Significance and Supplements. Free Rad Res 2000; 32: 381-97.



ADRES DO KORESPONDENCJI

dr med. Krzysztof Roszkowski

Katedra Biochemii Klinicznej

Akademia Medyczna

ul. Karłowicza 24

85-092 Bydgoszcz

tel. (052) 585 37 45

fax (052) 585 37 71

Roszkowskik@rco.pl