CD105 expression in bone marrow cells and peripheral blood lymphocytes in children with cancer

Wstęp
W szpiku kostnym oprócz komórek macierzystych hematopoezy znajdują się komórki macierzyste podścieliska, nazywane mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Mają one zdolność do różnicowania się w komórki tkanki mezenchymalnej (takie jak osteocyty, chondrocyty i adipocyty) w warunkach in vivo i in vitro [1]. Multipotencjalne komórki mezenchymalne dawcy mogą ułatwiać rekonstytucję hematologiczną biorcy po przeszczepieniu zarówno krwi pępowinowej, jak i szpiku kostnego. Efekt ten jest lepiej wyrażony u dzieci niż u pacjentów dorosłych. W badaniach komórek mezenchymalnych szpiku kostnego, pochodzącego od zdrowych dawców, dzieci i dorosłych wykazano, że najlepiej były one charakteryzowane ekspresją antygenów CD105, CD90, CD44 i CD29 [2], słabszymi markerami tych komórek były antygeny CD73 i CD106, natomiast komórki te były pozbawione ekspresji CD34, CD45 i CD14 [3, 4]. Obecność antygenu CD105 na komórkach szpiku kostnego umożliwia zaszeregowanie ich do populacji komórek mezenchymalnych. Zasadnicza różnica w zakresie komórek mezenchymalnych pochodzących od dzieci i dorosłych polegała na 2-krotnie większym potencjale wzrostowym komórek dziecięcych, stwierdzanym po 112 dniach hodowli [2]. CD105 (endoglin) jest przezbłonową fosforylowaną glikoproteiną o masie 180 kDa [5]. Cząsteczka CD105 jest komponentą regulatorową kompleksu receptora dla TGF-b (transforming growth factor b), cytokiny zaangażowanej w procesie proliferacji, różnicowania i migracji komórek różnych komórek, w tym komórek szpiku kostnego [6, 7]. Jej funkcją jest modulacja odpowiedzi komórkowej TGF-b [7]. CD105 występuje w dwóch formach – L i S. Ekspresją CD105 charakteryzują się komórki mezenchymalne szpiku i innych tkanek, komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, makrofagi, prekursory erytroidalne szpiku płodów i dorosłych, a także syncytiotrofoblast [7–9]. Podwyższoną ekspresję CD105 stwierdzano także na komórkach endotelium naczyniowego w tkankach, w których dochodziło do intensywnej angiogenezy, takich jak tkanki regenerujące się, objęte procesem zapalnym lub w guzach nowotworowych [8, 10]. Ekspresję CD105 stwierdzono również na komórkach niemających cech endotelium o zróżnicowanej histologii [11, 12]. W guzach litych CD105 jest obecny na komórkach endotelium zarówno w naczyniach wewnątrz guza, jak i w tkankach wokół guza nowotworowego oraz w elementach podścieliska samego guza [8, 10]. W szczególności, CD105 posiada intensywną ekspresję w małych i prawdopodobnie również w niedojrzałych naczyniach guza, co wykazano w guzach gruczołu sutkowego, prostaty i żołądka [13–15]. Wykazano też obecność CD105 w cytoplazmie komórek nowotworowych [11, 12]. W tkance raka płuca, barwienie na CD105 wykazało jego obecność w rejonach aktywnej angiogenezy obejmującej obrzeże guza, natomiast było mniej zaznaczone w rejonie centralnym guza oraz było niewykrywalne w przylegającej prawidłowej tkance [16]. Celem pracy była analiza ekspresji antygenu CD105 w komórkach szpiku kostnym i krwi obwodowej u dzieci z chorobami nowotworowymi w różnych sytuacjach hematologicznych. Wyniki te odniesiono do ekspresji u dzieci zdrowych.
Pacjenci
Badania przeprowadzono wśród 84 pacjentów, których w zależności od rozpoznania klinicznego podzielono na 3 grupy (tab. 1.). Do grupy I włączono dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną (acute lymphoblastic leukemia – ALL) w momencie rozpoznania (szpik kostny, grupa IA) oraz w remisji, po zakończeniu terapii indukcyjnej (w szpiku kostnym, grupa IB i/lub krwi obwodowej, grupa IC). Z badań wykluczono pacjentów, u których stwierdzono ekspresję antygenu CD34 w momencie postawienia rozpoznania (ze względu na potencjalną koekspresję markera nowotworowego). Do grupy II włączono pacjentów z guzami litymi, których po zakończeniu chemioterapii, zakwalifikowano do mobilizacji komórek hematopoetycznych i poddano przeszczepieniu autologicznych komórek hematopoetycznych. U pacjentów tych wykonywano badania we krwi obwodowej w trakcie aferez (grupa IIA). Oznaczenie wykonywano po co najmniej 3 dobach podawania G-CSF (Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA, USA), w dobach 4.–8. W dniu poprzedzającym oznaczenie podawano podskórnie G-CSF. U 5 pacjentów podawano G-CSF w 2 niezależnych cyklach, ze względu na brak dostatecznej kolekcji komórek hematopoetycznych w poprzednim cyklu. Badania przeprowadzono również w aferezacie (tj. produkcie aferezy komórek hematopoetycznych) krwi obwodowej (grupa IIB). W 6 przypadkach wykonano badania w szpiku kostnym po stymulacji G-CSF, który pobierano jako źródło komórek hematopoetycznych ze względu na niemożność przeprowadzenia separacji komórek krwi obwodowej (grupa IIC). U pacjentów w 28 dni po przeszczepieniu komórek hematopoetycznych (co najmniej 7 dni bez G-CSF) wykonano oznaczenia w szpiku kostnym (grupa IID). Do grupy III włączono dzieci z prawidłowym szpikiem kostnym (zdrowi dawcy szpiku kostnego lub pacjenci diagnozowani w kierunku choroby nowotworowej, u których nie potwierdzono tego rozpoznania, jak również objawów niewydolności szpiku), u których oznaczono ekspresję badanych antygenów w komórkach szpiku kostnego (grupa IIIA) i krwi obwodowej (grupa IIIB).
Metodyka
We wszystkich przypadkach wykonywano oznaczenia komórek CD105+ i komórek CD34+. Oznaczenia wykonywano na cytometrze przepływowym (Cytomics FC500, Beckman-Coulter, Miami, FL, USA). Ekspresję błonowego antygenu CD105 oznaczano, stosując mysie hybrydowe przeciwciało monoklonalne anty-CD105-RPE (Caltag, Burlingame, CA, USA) z mysią kontrolą izotypową anty-IgG1. Ekspresję CD34 badano stosując protokół ISHAGE, z jednoczesnym typowaniem komórek CD45+CD14- [17]. Według protokołu ISHAGE, populacja komórek hematopoetycznych znajduje się w obrębie komórek o parametrach odpowiadających limfocytom [17]. Do badań użyto następujące przeciwciała monoklonalne: anty-CD34-PerCP-Cy5.5 i CD14-PE/CD45-FITC (wszystkie Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA). Oznaczano odsetek komórek wykazujących ekspresję badanego antygenu oraz średnią intensywność fluorescencji (MFI – mean fluorescence intensity) dla komórek wiążących odpowiednie przeciwciało sprzężone z fluorochromem. Aferezę komórek hematopoetycznych do ich przeszczepienia autologicznego wykonywano na separatorze Cobe-Spectra (Gambro, Lakewood, CO, USA). Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę lokalnej komisji bioetycznej.
Metody statystyczne
Badane parametry przedstawiono jako medianę i zakres wartości. Różnice badanych parametrów pomiędzy badanymi grupami oznaczano testem U Manna-Whitneya. Korelacje oceniono testem Spearmana.
Wynik
W badaniach wykazano dużą zmienność wyników w obrębie grup oraz pomiędzy grupami (tab. 2.). Stwierdzono większy odsetek komórek CD105 w szpiku niż we krwi obwodowej u dzieci zdrowych (mediana 0,48 vs 0,29%, p=0,049), w trakcie chemioterapii (mediana 0,69 vs 0,28%, p=0,042) oraz po stymulacji G-CSF (mediana 0,92 vs 0,28%, p=0,001). U dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną linii B-komórkowej w momencie rozpoznania stwierdzano podwyższony odsetek komórek CD105 (grupa IA). Odsetek ten zmniejszał się w trakcie chemioterapii (grupa IB), lecz był wyższy niż w grupie kontrolnej (grupa IIIA). U pacjentów z guzami litymi, poddawanych stymulacji G-CSF przed separacją komórek hematopoetycznych, nastąpił wzrost ekspresji komórek o fenotypie CD105 w szpiku kostnym (mediana 0,92 vs 0,48% w prawidłowym szpiku kostnym, p=0,065). Zjawiska tego nie obserwowano we krwi obwodowej po stymulacji G-CSF (mediana 0,29 vs 0,28%, grupa IIA). Afereza komórek jednojądrzastych również nie powodowała wzrostu kolekcji komórek CD105 (mediana 0,32 vs 0,28%, grupa IIB). Po 28 dniach po przeprowadzeniu zabiegu transplantacji komórek hematopoetycznych, stwierdzono wzrost odsetka komórek CD105 w szpiku kostnym (1,19 vs 0,48% u pacjentów zdrowych). W równolegle wykonanych badaniach ekspresji swoistego antygenu komórek hematopoetycznych CD34+ wykazano większą ekspresję tego antygenu w szpiku kostnym niż we krwi obwodowej u osób zdrowych (mediana 0,55 vs 0,01%, p<0,001), w trakcie chemioterapii (0,08 vs 0,02%, p=0,003) oraz po stymulacji G-SCF, zarówno w szpiku kostnym mediana (2,13 vs 0,55%, p<0,001), jak i we krwi obwodowej (mediana 0,13 vs 0,01%, p<0,001). Odsetek komórek CD34 w aferezacie był 4,5-krotnie wyższy niż w odpowiadającym mu odsetkowi komórek CD34 we krwi obwodowej oznaczanym równolegle (mediana 0,59 vs 0,13%, p<0,001). Wzrost odsetka komórek CD34 po 3-dniowej stymulacji G-CSF był wyższy w szpiku niż we krwi obwodowej (mediana 2,13 vs 0,13%, p=0,002). Po przeszczepieniu komórek hematopoetycznych, w odróżnieniu od komórek CD105, nie stwierdzono istotnego wzrostu odsetka komórek CD34 (0,61 vs 0,55%). Nie stwierdzono korelacji pomiędzy ekspresją CD105 i CD34 ani w badaniach szpiku kostnego, ani krwi obwodowej, ani dla wszystkich badań łącznie (p=0,211, ryc. 1.).
Dyskusja
Antygen CD105 występuje na błonie komórkowej komórek mezenchymalnych, jak również proliferujących komórek śróbłonkowych. W hodowli komórek mezenchymalnych szpiku kostnego pacjentów z nowotworami hematologicznymi, o fenotypie CD105, CD90, CD184, HLA-DR stwierdzono, że wraz z nasileniem procesu angiogenezy następował spadek ekspresji CD105 i CD90 [18]. W przeprowadzonych badaniach w prawidłowym szpiku kostnym, po stymulacji z G-CSF stwierdzono prawie 2-krotny wzrost ekspresji komórek CD105+, co wskazuje na podatność tej populacji komórek na działanie czynników wzrostu hematopoezy. W populacji tej były zarówno komórki mezenchymalne, jak i związane z angiogenezą [1, 9]. We krwi obwodowej odsetek komórek CD105 był niższy niż w szpiku kostnym, a po stymulacji z G-CSF ich odsetek nie wzrastał ani we krwi (grupa IIA), ani w aferezacie (grupa IIB). Ta populacja komórek była związana głównie z angiogenezą, a w znacznie mniejszym stopniu z komórkami mezenchymalnymi. U dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną z prekursorów linii B-komórkowej (poza białaczkami z koekspresją antygenu CD34), odsetek komórek z ekspresją CD105 był wyższy niż w prawidłowym szpiku kostnym i wynosił 1,06%. W tej grupie pacjentów, antygen CD105 był związany z obecnością komórek mezenchymalnych, komórkami uczestniczącymi w angiogenezie, jak również występował częściowo na komórkach nowotworowych jako marker złośliwości komórek [18, 19]. W badaniach Al-Mowallad i wsp. u dzieci z ALL, w porównaniu z dziećmi zdrowymi, stwierdzono podwyższoną ekspresję osoczowego antygenu CD105, przy jednoczesnym obniżeniu stężenia TGF-b3, jednak zarówno CD105, jak i TGF-b3 nie miały znaczenia prognostycznego [19]. Zaobserwowaliśmy również, że w stosunku do grupy kontrolnej, odsetek komórek z ekspresją CD105 był wyższy w pozostałych badanych grupach. Zarówno w szpiku kostnym, jak i krwi obwodowej w trakcie chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej (w remisji, podczas badań kontrolnych wykonywanych planowo przed kolejnym etapem chemioterapii) wyższa ekspresja CD105 niż w grupie kontrolnej mogła się wiązać zarówno z pobudzeniem angiogenezy, jak również ze wzrostem potencjału regeneracyjnego związanego z obecnością komórek mezenchymalnych; ale może też oznaczać przetrwanie komórek białaczkowych, czyli obecność minimalnej choroby resztkowej. Znaczny wzrost odsetka komórek CD105 dodatnich obserwowano natomiast u pacjentów w 28 dni po przeszczepieniu autologicznych komórek hematopoetycznych. Zjawisko to było związane ze zwiększoną odbudową szpiku kostnego, przy niewątpliwym dużym udziale komórek mezenchymalnych. Antygen CD105 występuje również z różną ekspresją na komórkach nowotworowych, mając różne znaczenie prognostyczne. Wysoka ekspresja tego antygenu okazała się niekorzystnym czynnikiem rokowniczym u pacjentów z rakiem jamy ustnej [20], jajnika [21], krtani [22], języka [23], jelita grubego [24]. Ekspresja antygenu CD105 w mikrokrążeniu (w badaniu immunohistochemicznym) była niezależnym czynnikiem prognostycznym wznowy i przerzutów u pacjentów z rakiem wątroby (hepatocelular carcinoma) [25]. Natomiast wysoka ekspresja CD105 w tkance raka jasnokomórkowego nerki miała korzystne znaczenie prognostyczne [26]. W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono korelacji pomiędzy odsetkami komórek CD34 i komórek CD105, co wynika z faktu, że markery te charakteryzują odmienne populacje komórkowe. Niewielki odsetek progenitorowych komórek hematopoetycznych, który posiada fenotypowe i funkcjonalne cechy bardzo niedojrzałych komórek hematopoetycznych, posiada jednak ekspresję antygenu CD105. Komórki CD34+/CD105+ krążą we krwi obwodowej w wyniku mobilizacji. Potencjał hematopoetyczny komórek CD34+/CD105+ jest wzmacniamy poprzez skojarzone działanie cytokin zarówno o działaniu hematopoetycznym, jak i niezwiązanym bezpośrednio z hematopoezą, takich jak ligand Flt3, erytropoetyna, interleukina-15, naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) oraz endogenny TGF-b1. CD105 jest nieobecny na bardzo prymitywnych ludzkich komórkach hematopoetycznych CD34-/lineage-/CD45+ (CD34-Lin-) obecnych we krwi pępowinowej. Jednak komórki te poddane działaniu TGF-b1 in vitro, podlegają dojrzewaniu i różnicowaniu do komórek CD34+/CD105+ [27]. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że ekspresja antygen CD105 u dzieci może być podwyższona w różnych sytuacjach. Na jego ekspresję może mieć wpływ chemioterapia, podawanie hematopoetycznych czynników wzrostu, jak również rozwój ostrej białaczki limfoblastycznej. Ekspresja antygenu CD105 w szpiku i we krwi jest prawdopodobnie wypadkową ekspresji różnych, częściowo nakładających się populacji komórkowych. Otrzymane wyniki należy jednak traktować ostrożnie, ponieważ najczęściej porównywano grupy różnych pacjentów. Praca powstała w ramach realizacji projektu uczelnianego BW 22/2006.
Piśmiennictwo
1. Oswald J, Boxberger S, Jorgensen B, Feldmann S, Ehninger G, Bornhauser M, Werner C. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells 2004; 22: 377-84. 2. Mareschi K, Ferrero I, Rustichelli D, Aschero S, Gammaitoni L, Aglietta M, Madon E, Fagioli F. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. J Cell Biochem 2006; 97: 744-54. 3. Pozzi S, Lisini D, Podesta M, et al. Donor multipotent mesenchymal stromal cells may engraft in pediatric patients given either cord blood or bone marrow transplantation. Exp Hematol 2006; 34: 934-42. 4. Finney MR, Greco NJ, Haynesworth SE, et al. Direct comparison of umbilical cord blood versus bone marrow-derived endothelial precursor cells in mediating neovascularization in response to vascular ischemia. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 585-93. 5. Gougos A, Letarte M. Primary structure of endoglin, an RGD-containing glycoprotein of human endothelial cells. J Biol Chem 1990; 265: 8361-4. 6. Lastres P, Martin-Perez J, Langa C, Bernabeu C. Phosphorylation of the human-transforming-growth-factor-beta-binding protein endoglin. Biochem J 1994; 301: 765-8. 7. Lastres P, Letamendia A, Zhang H, et al. Endoglin modulates cellular responses to TGF-beta 1. J Cell Biol 1996; 133: 1109-21. 8. Burrows FJ, Derbyshire EJ, Tazzari PL, et al. Up-regulation of endoglin on vascular endothelial cells in human solid tumors: implications for diagnosis and therapy. Clin Cancer Res 1995; 1: 1623-34. 9. Fonsatti E, Jekunen AP, Kairemo KJ, et al. Endoglin is a suitable target for efficient imaging of solid tumors: in vivo evidence in a canine mammary carcinoma model. Clin Cancer Res 2000; 6: 2037-43. 10. Wang JM, Kumar S, Pye D, van Agthoven AJ, Krupinski J, Hunter RD. A monoclonal antibody detects heterogeneity in vascular endothelium of tumours and normal tissues. Int J Cancer 1993; 54: 363-70. 11. Fonsatti E, Altomonte M, Nicotra MR, Natali PG, Maio M. Endoglin (CD105): a powerful therapeutic target on tumor-associated angiogenetic blood vessels. Oncogene 2003; 22: 6557-63. 12. Fonsatti E, Altomonte M, Arslan P, Maio M. Endoglin (CD105): a target for anti-angiogenetic cancer therapy. Curr Drug Targets 2003; 4: 291-6. 13. Wang JM, Kumar S, Pye D, Haboubi N, al-Nakib L. Breast carcinoma: comparative study of tumor vasculature using two endothelial cell markers. J Natl Cancer Inst 1994; 86: 386-8. 14. Wikstrom P, Lissbrant IF, Stattin P, Egevad L, Bergh A. Endoglin (CD105) is expressed on immature blood vessels and is a marker for survival in prostate cancer. Prostate 2002; 51: 268-75. 15. Yu JX, Zhang XT, Liao YQ, Zhang QY, Chen H, Lin M, Kumar S. Relationship between expression of CD105 and growth factors in malignant tumors of gastrointestinal tract and its significance. World J Gastroenterol 2003; 9: 2866-9. 16. Miller DW, Graulich W, Karges B, et al. Elevated expression of endoglin, a component of the TGF-beta-receptor complex, correlates with proliferation of tumor endothelial cells. Int J Cancer 1999; 81: 568-72. 17. Barnett D, Janossy G, Lubenko A, Matutes E, Newland A, Reilly JT. Guideline for the flow cytometric enumeration of CD34+ haematopoietic stem cells. Prepared by the CD34+ haematopoietic stem cell working party. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. Clin Lab Haematol 1999; 21: 301-8. 18. Campioni D, Moretti S, Ferrari L, Punturieri M, Castoldi GL, Lanza F. Immunophenotypic heterogeneity of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells from patients with hematologic disorders: correlation with bone marrow microenvironment. Haematologica 2006; 91: 364-8. 19. Al-Mowallad A, Carr T, Al-Qouzi A, Li C, Byers R, Kumar S. Plasma CD105, TGFbeta-1, TGFbeta-3 and the ligand/receptor complexes in children with acute lymphoblastic leukaemia. Anticancer Res 2006; 26: 543-7. 20. Chien CY, Su CY, Hwang CF, Chuang HC, Chen CM, Huang CC. High expressions of CD105 and VEGF in early oral cancer predict potential cervical metastasis. J Surg Oncol 2006; 94: 413-17. 21. Taskiran C, Erdem O, Onan A, et al. The prognostic value of endoglin (CD105) expression in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Cancer 2006; 16: 1789-93. 22. Marioni G, Ottaviano G, Giacomelli L, Staffieri C, Casarotti-Todeschini S, Bonandini E, Staffieri A, Blandamura S. CD105-assessed micro-vessel density is associated with malignancy recurrence in laryngeal squamous cell carcinoma. Eur J Surg Oncol 2006. 23. Chuang HC, Su CY, Huang HY, Chien CY, Chen CM, Huang CC. High expression of CD105 as a prognostic predictor of early tongue cancer. Laryngoscope 2006; 116: 1175-9. 24. Romani AA, Borghetti AF, Del Rio P, Sianesi M, Soliani P. The risk of developing metastatic disease in colorectal cancer is related to CD105-positive vessel count. J Surg Oncol 2006; 93: 446-55. 25. Yang LY, Lu WQ, Huang GW, Wang W. Correlation between CD105 expression and postoperative recurrence and metastasis of hepatocellular carcinoma. BMC Cancer 2006; 6: 110. 26. Sandlund J, Hedberg Y, Bergh A, Grankvist K, Ljungberg B, Rasmuson T. Endoglin (CD105) expression in human renal cell carcinoma. BJU Int 2006; 97: 706-10. 27. Pierelli L, Bonanno G, Rutella S, Marone M, Scambia G, Leone G. CD105 (endoglin) expression on hematopoietic stem/progenitor cells. Leuk Lymphoma 2001; 42: 1195-206.
Adres do korespondencji
dr hab. med. Jan Styczyński Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet im. Mikołaja Kopernika ul. Skłodowskiej-Curie 9 85-094 Bydgoszcz tel. +48 52 585 48 60 faks +48 52 585 48 67 e-mail: jstyczynski@cm.umk.pl