C-erbB2 (Her-2/neu) gene amplification in women with breast cancer – initial studies

Wstęp


Poznanie znaczenia onkogenów oraz genów supresorowych stworzyło nowe możliwości w wykorzystaniu markerów nowotworowych. W ostatnich latach liczne badania dokumentują, że zmiany (punktowe mutacje, nadekspresja) onkogenów i genów supresorowych mogą być wykrywane w ludzkich tkankach nowotworowych. Mogą one odgrywać rolę użytecznych molekularnych markerów dla poznania procesu kancerogenezy in vivo.
Bezpośrednie wykrywanie genetycznych zaburzeń wymaga dostępu do DNA lub mRNA tkanek macierzystych. Wykrywanie zmutowanych postaci genów, zmiany stopnia ich ekspresji a co za tym idzie – zmiany ilości onkoprotein we krwi może być zastosowane jako molekularne markery kancerogenezy. Zalicza się do nich czynniki wzrostowe, receptory międzybłonowych czynników wzrostu, onkogeny kodujące białka cytoplazmatyczne uczestniczące w wewnątrzkomórkowej transmisji sygnału oraz onkogeny kodujące białka o charakterze czynników transkrypcyjnych [2].

Jednym z najlepiej poznanych onkogenów kodujących białka o charakterze receptorów czynników wzrostowych o aktywności kinazy tyrozynowej jest onkogen erbB. Przekształcenie protoonkogenu erbB jest wynikiem delecji znacznej części zewnątrzkomórkowej domeny białka wiążącego ligand. W nowotworach ludzkich obserwuje się zwiększoną ekspresję genów kodujących białka o charakterze receptorów transbłonowych czynników wzrostu (szczególnie c-erbB1 i c-erbB2) [7, 10]. Proces wzrostu sygnału transdukcji dla tych receptorów ukazuje włączenie dimeryzacji ze wzrostem wewnątrzkomórkowej aktywności kinazy tyrozynowej przez proteolityczne cięcie domeny zewnątrzkomórkowej (ECD) receptora, ze zgromadzeniem ECD w środowisku zewnątrzkomórkowym. Dlatego wykrycie wzrostu poziomu receptora c-erbB2 we krwi staje się potencjalnym molekularnym markerem dla rozwoju raka [9, 11, 12].
Onkogen c-erbB2 jest zlokalizowany na ramieniu dłuższym chromosomu 17 i koduje glikoproteinę o masie 185 kD, o funkcji receptora kinazy tyrozynowej. Zwiększoną ekspresję genu c-erbB2 stwierdza się w ok. 20–30 proc. raków sutka [1, 3, 4]. Wykazano zależność pomiędzy zaburzeniami tego onkogenu a obecnością przerzutów w węzłach chłonnych, wczesnymi nawrotami choroby i krótkim czasem przeżycia [6, 8].
W prezentowanych badaniach podjęto próbę określenia stopnia amplifikacji genu c-erbB2 u kobiet chorych na raka sutka w wieku menopauzalnym. W tym celu zastosowano reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).


Materiał i metody

Pacjentki

Materiał do badań stanowiły pobrane z materiału pooperacyjnego, a następnie utrwalone w parafinie wycinki guzów piersi (n=20). Średnia wieku pacjentek wynosiła 58 lat. Grupę kontrolną stanowiły próbki krwi uzyskane od kobiet (n=20), u których nie stwierdzono występowania nowotworu.
Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) do badań był izolowany przy zastosowaniu komercyjnie dostępnego zestawu OIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). W przypadku tkanek utrwalonych w parafinie przed izolowaniem DNA prowadzono ich deparafinizację ksylenem i etanolem.

Amplifikacja genu c-erbB2

W celu amplifikacji genu c-erbB2 zastosowano następujące startery o sekwencjach: 5'-CCT CTG ACG TCT TCG ACC TC-3' oraz 5'- ATC TCT CTG CTG CCG TCG TCG CTT -3'. Reakcja PCR została przeprowadzona w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400 thermal cycler. Warunki reakcji PCR były następujące: 1 min w 94°C, 1 min w 60°C, 1 min w 72°C, przez 33 cykle. Mieszanina reakcyjna (25 ml) obejmowała: 30 ng genomowego DNA, 0,2 µmol każdego startera (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Niemcy), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTPs and 1 U polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). Wyniki reakcji PCR były analizowane w 5-procentowym żelu poliakryloamidowym po barwieniu bromkiem etydyny (ryc. 1.).


Wyniki


Stwierdzono znacząco wyższą częstość amplifikacji genu c-erbB2 w grupie badanej (0,70) w porównaniu z grupą kontrolną (0,10) (tab. I.). Różnice pomiędzy obu badanymi grupami były statystycznie istotne (p<0,05) (ryc. 2.).


Dyskusja


Zmiana stopnia ekspresji genu c-erbB2 została po raz pierwszy opisana w 1988 r przez van de Vijvera i wsp. w raku sutka in situ [11]. Wysoka ekspresja tego genu we wczesnym stadium rozwoju nowotworu wskazywała, że może on mieć znaczenie dla jego rozwoju. Niski poziom ekspresji w zmianach łagodnych potwierdzał te przypuszczenia. W kolejnych badaniach podjęto próby określenia zależności pomiędzy zaburzeniami genu c-erbB2 a odpowiedzią na hormono- i chemioterapię. Stwierdzono, że chorzy z guzami, w których występuje wzrost aktywności c-erbB2 wykazują oporność na hormonoterapię, niezależnie od obecności receptorów estrogenowych. Brak było natomiast jednoznacznych wyników skuteczności chemioterapii u tych chorych [5, 8].

W analizach do oznaczania aktywności genu c-erbB2 stosuje się technikę Southern blot, FISH (ang. fluorescence in situ hybridization) oraz PCR [5, 10]. W prezentowanych badaniach podjęto próbę oznaczenia stopnia amplifikacji genu c-erbB2 przy zastosowaniu reakcji PCR. Metoda ta wymaga małej ilości DNA, co pozwoliło na wykorzystanie w doświadczeniach oprócz krwi także próbki tkanek utrwalonych w parafinie.

Przeprowadzone badania sugerują, że zwiększona amplifikacja genu c-erbB2 jest związana z występowaniem raka sutka u kobiet, jednakże konieczna jest analiza większej populacji dla potwierdzenia tego przypuszczenia.


Piśmiennictwo

1. Allred DG, Clark G M, Mollina R. Overexpression of Her2/neu and its relationship with other prognostic factor changes during the progression of in situ to invasive breast cancer. Hum Pathol, 1992, 23, 974-9.
2. Brandt-Rauf P, Pincus MR. Molecular markers of carcinogenesis. Pharmacol Ther, 1998, 77, 135-48.
3. Liu ET, Thor AD, He M. The Her-2 (c-erb2) oncogene is frequently amplified in in situ carcinomas of the breast. Oncogene, 1992, 7, 1027-32.
4. Pechoux C, Chardonnet Y, Noel P. Immunochistochemical studies on c-erb2 oncoprotein expression in paraffin embedded tissue in invasive and non-invasive human breast lesions. Anticancer Res, 1994, 14, 1343-50.
5. Persons DL, Borelli KA, Hsu PH. Quantitation of Her2/neu and c-myc gene amplification in breast carcinoma using fluorescence in situ hybridisation. Mod Pathol, 1997, 10, 720-7.
6. Revillon F, Bonneterre J, Peyrat J P. ERBB2 oncogene in human breast cancer and its clinical significance. Eur J Cancer, 1998, 34, 791-808.
7. Selim AG, El-Ayat G, Wells A.: c-erb2 oncoprotein expression, gene amplification, and chromosome 17 aneusomy in apocrine adenosis of the breast. J Pathol, 2000, 191, 138-142.
8. Sjogren S, Inganas M, Lindgren A, et al. J. Prognostic and predictive value of c-erbB2 overexpression in primary breast cancer, alone and in combination with other prognostic markers. J Clin Oncol, 1998, 16, 462-9.
9. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the Her-2/neu oncogene. Science, 1987, 235, 177-81.
10. Stark A, Hulka B, Joens S, Novotny D, et al. Her-2/neu amplification in beningn breast disease and the risk of subsequent breast cancer. J Clin Oncol, 2000, 18, 267-4.
11. Van de Vijver M J, Peters J L, Moor W J. Neu-protein overexpression in breast cancer: Association with comedo-type ductal carcinoma in situ and limited prognostic value in stage II breast cancer. N Engl J Med, 1988, 319, 1239-45.
12. Zhou D, Battifora H, Yokota J. Association of multiple copies of the c-erb2 oncogene with spread of breast cancer. Cancer Res, 1987, 47, 6123-5.


Adres do korespondencji

Zakład Patomorfologii Klinicznej,
Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki
Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48-42 271 12 80
fax +48-42 271 14 21