The effect of atorvastatin on the erythrocyte plasma membrane and C-reactive protein in menopausal women with metabolic syndrome

Wstęp
Na przestrzeni minionych 20 lat zaobserwowano wzrost częstości występowania zespołu metabolicznego (ZM), który osiąga obecnie proporcje globalnej epidemii [1]. W konsekwencji zwiększyła się znacznie liczba badań naukowych prowadzonych w tej jednostce chorobowej, mająca na celu rozszerzenie panelu diagnostycznego i terapeutycznego. Częstość występowania ZM u kobiet wzrasta wyraźnie po 45. roku życia, co wiąże się z okresem menopauzy [2–4]. Wraz ze zmniejszeniem stężenia estrogenów w organizmie obserwuje się zmiany w dystrybucji tłuszczu: zwiększa się magazynowanie tłuszczu w okolicy pośladkowo-udowej (gynoid) i brzusznej (android) [5]. Otyłość brzuszna jest stanem indukującym reakcje zapalne (zwiększenie stężenia białka C-reaktywnego – CRP oraz cytokin prozapalnych), insulinooporność. W konsekwencji dochodzi do rozwoju dyslipidemii: małego stężenia cholesterolu frakcji HDL, podwyższonego stężenia triglicerydów (TG), nietolerancji glukozy, nadciśnienia tętniczego oraz złożonych zaburzeń hemoreologicznych [6]. Dobrze udokumentowany jest wpływ poszczególnych składowych ZM, zwłaszcza hiperfibrynogenemii, hiperlipoproteinemii na zwiększoną agregację krwinek czerwonych [7, 8]. Patologiczny wzrost lepkości prowadzi do uszkodzenia błony plazmatycznej erytrocytu, powodując zmniejszenie jej płynności, utratę zdolności komórki do odkształceń. Wykazano, że płynność błony w największym stopniu zależy od zawartości cholesterolu błonowego, fosfolipidów i stopnia nasycenia kwasów tłuszczowych [9]. Zmiany w stężeniu cholesterolu błonowego mogą wpływać na aktywność enzymów błonowych, w tym ATP-azy-Na+/K+. Obniżona aktywność tego enzymu zaburza transport jonów sodu, potasu i prowadzi do utraty kontroli nad objętością komórki (ryc. 1.) [10].
Początkowo w leczeniu zaburzeń lipidowych w ZM podkreślano rolę fibratów, jako grupy leków najpełniej ingerującej w tego typu zaburzenia, dodatkowo wykazującej aktywność antyoksydacyjną oraz korzystnie wpływającej na metabolizm glukozy, czynniki prozakrzepowe i prozapalne.
Analizy post hoc dużych badań klinicznych z zastosowaniem statyn wykazały, że u pacjentów z ZM leki te zmniejszają ryzyko sercowo-naczyniowe, pomimo że ich wpływ na stężenia TG i frakcji HDL cholesterolu wydaje się niewystarczający. Udowodniono korzystny wpływ statyn na zmniejszenie insulinooporności, stężenia małych gęstych LDL, poprawę funkcji śródbłonka oraz ograniczenie reakcji zapalnej [11].

Cel pracy
Celem badania była ocena wpływu atorwastatyny na lipidy osocza, hsCRP oraz na strukturę błony erytrocytów (cholesterol błonowy i aktywność ATP-azy-Na+/K+) u kobiet w okresie menopauzalnym z ZM.

Materiał i metody
Badaniami objęto 20 kobiet w okresie menopauzalnym (średnia wieku wynosiła 55 ±3,69 roku), które spełniały następujące kryteria ZM: obwód talii ł 80 cm, stężenie TG > 150 mg/dl, stężenie frakcji HDL cholesterolu < 50 mg/dl oraz łagodne nadciśnienie tętnicze < 150/100 mm Hg. Kryteriami wykluczającymi z badania były: cukrzyca, umiarkowane i ciężkie nadciśnienie tętnicze, ostre i przewlekłe choroby zapalne, niewydolność krążenia, niewydolność nerek i wątroby, stosowanie leków hipolipemicznych, terapii hormonalnej oraz znajdowanie się w okresie rozrodczym. Grupę kontrolną stanowiło 18 zdrowych kobiet w okresie menopauzy w wieku 55 ±6,48 roku.
Program badań obejmował 20 tyg. Przez pierwsze 8 tyg. pacjentkom z ZM zalecano systematyczny wysiłek fizyczny i dietę niskotłuszczową. Następnie, u pacjentek spełniających kryteria kwalifikacji, zastosowano leczenie hipolipemiczne – atorwastatynę doustnie w dawce 10 mg/dobę. Wizyty kontrolne zlecono przed terapią, 4 i 12 tyg. po upływie aktywnego leczenia. Podczas wizyt przeprowadzono badanie kliniczne, oznaczano następujące parametry: masę ciała, obwód pasa, wskaźnik masy ciała (body mass index –BMI), lipidogram osocza, glukozę na czczo, hsCRP oraz w błonach erytrocytarnych stężenie cholesterolu i aktywność ATP-azy-Na+/K+.
Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr RNN/58/06/KB z 21.02.2006 r.
Lipidogram osocza
Stężenia TC, frakcji LDL i HDL cholesterolu oraz TG oznaczano metodą enzymatyczną za pomocą zestawów firmy bioMerieux. Wyniki oznaczeń wyrażono w mg/dl.
Preparatyka erytrocytów
Krew żylną pobierano do probówek, używając ACD jako antykoagulantu (o składzie 23 mM kwasu cytrynowego, 45,1 mM cytrynianu sodu, 45 mM glukozy). Następnie krew wirowano przez 10 min w temp. 4°C (3000 obr./min) w celu usunięcia osocza i warstwy leukocytów. Uzyskane w ten sposób erytrocyty przemywano trzykrotnie 0,9-procentowym roztworem NaCl. Zawieszano je w buforze i doprowadzano do końcowego hematokrytu 50%.
Preparatyka błon erytrocytarnych
Błony plazmatyczne erytrocytów otrzymywano w wyniku hemolizy hipotonicznej wg metody Dodge’a i wsp. [12]. Hemoliza komórek odbywała się w 20-milimolowym buforze fosforanowym EDTA (sól dwusodowa kwasu etylenodiaminoczterooctowego) i PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) w stosunku molowym 1 : 5, pH = 7,4. Błony przemywano 10-milimolowym buforem fosforanowym, a następnie 5-milimolowym buforem fosforanowym. Preparatykę przeprowadzono w temperaturze +40°C.
Oznaczanie cholesterolu w błonach erytrocytarnych
Ekstrakcję lipidów z błon erytrocytarnych przeprowadzono z użyciem rozpuszczalników o małej toksyczności wg metody Rodrigeza i Martineza [13]. Cholesterol błonowy oznaczano z użyciem odczynnika Liebermana-Burcharda metodą Ilcy [14].
Oznaczanie aktywności ATP-azy-Na+/K+ i CRP
Aktywność ATP-azy-Na+/K+ badano metodą opartą na pomiarze poziomu uwolnionego ortofosforanu wg Bartosza i wsp. [15], natomiast hsCRP oznaczono metodą immunoenzymatyczną o wysokiej czułości (ELISA) za pomocą testów firmy DRG.
Metody statystyczne
Do analizy statystycznej w przypadku, gdy rozkład badanych cech był zgodny z rozkładem normalnym, zastosowano test t-Studenta. W pozostałych przypadkach testy: dla par powiązanych – test Wilcoxona.

Wyniki
Charakterystykę pacjentek z ZM oraz grupy kontrolnej przedstawiono w tabelach I i II. W grupie kobiet z ZM w porównaniu z grupą kontrolną, obserwowano istotnie większe średnie wartości: masy ciała, obwodu pasa, BMI, stężenia TC, frakcji LDL cholesterolu, TG, hsCRP, glukozy na czczo oraz cholesterolu w błonach erytrocytów. Aktywność ATPazy-Na+/K+ była istotnie niższa w grupie chorych niż w grupie kontrolnej. Średnie stężenie frakcji HDL cholesterolu u pacjentek ze stwierdzonym ZM było istotnie mniejsze niż w grupie kontrolnej.
Po 12 tyg. terapii w grupie chorych leczonych atorwastatyną zanotowano istotne zmniejszenie stężenia: TC, frakcji LDL cholesterolu i TG. Masa ciała, obwód pasa oraz BMI zmniejszyły się o kilka procent, średnie wartości tych parametrów były jednak nadal istotnie większe niż w grupie kontrolnej. Średnie stężenie glukozy na czczo nie ulegało istotnym zmianom (tab. I). W błonach erytrocytarnych obserwowano istotnie mniejsze stężenie cholesterolu błonowego. Już po 4 tyg. terapii stężenie zmniejszyło się o 47%, na tym poziomie utrzymywała się jego wartość przez kolejne 8 tyg. terapii, osiągając podobne wartości jak w grupie kontrolnej. Aktywność ATP-azy-Na+/K+ już po 4 tyg. leczenia atorwastatyną osiągnęła wartość wyższą niż w grupie kontrolnej i taki kierunek zmian utrzymywał się do końca obserwacji. Po 12 tyg. terapii aktywność w badanej grupie była wyższa o 29% w porównaniu z grupą kontrolną (tab. II). Zaobserwowano również istotne obniżenie stężenia hsCRP po 12 tyg. leczenia, jednakże po leczeniu wartość tego parametru była wciąż wyższa niż w grupie kontrolnej (tab. I).
W trakcie terapii kontrolowano próby wątrobowe (ALAT, ASAT), bilirubinę, kinazę keratynową (CPK) oraz kreatyninę. Nie odnotowano żadnych istotnych zmian tych parametrów. Lek był dobrze tolerowany przez pacjentki. Żadna z chorych nie przerwała leczenia.

Omówienie wyników
Choroby układu sercowo-naczyniowego (cardiovascular disease – CVD) są najczęstszą przyczyną śmiertelności u kobiet. Zawężając kryteria selekcji – u kobiet ok. 65. roku życia w krajach uprzemysłowionych CVD są częstszą przyczyną zgonów niż szeroko pojęte choroby nowotworowe [16]. Największy wzrost zachorowalności na CVD notuje się w grupie kobiet, które ukończyły 50. rok życia i u których zbiegają się w czasie początek menopauzy, niesprzyjające zmiany metaboliczne pojawiające się podczas przejściowych okresów okołomenopauzalnych i później pomenopauzalnych [17, 18]. W szczególności zmiany zachodzące w metabolizmie lipidów, które to przypisywane są deficytowi estrogenów, uważa się za istotny czynnik ryzyka wzrostu zachorowalności na CVD u kobiet w okresie menopauzy [19].
Kobiety przed menopauzą mają zwykle mniejsze stężenie frakcji LDL, a większe frakcji HDL cholesterolu niż mężczyźni w ich wieku, a to oznacza, że ryzyko wystąpienia CVD jest również niższe w przypadku kobiet. Niestety, podczas przechodzenia z okresu przedmenopauzalnego do pomenopauzalnego stężenia frakcji LDL cholesterolu, TG [20] i lipoproteiny (a), niezależnego czynnika ryzyka CVD, się zwiększają [21]. Współistnienie w tym okresie otyłości brzusznej bez wątpienia nasila zaburzenia lipidowe, czego dowodem są wyniki przeprowadzonego przez autorów niniejszej pracy badania. Stężenie lipidów w osoczu (TC, frakcji LDL cholesterolu, TG) było istotnie statystycznie większe, natomiast stężenie frakcji HDL cholesterolu było mniejsze w odniesieniu do grupy kontrolnej.
Liczne badania dowodzą, że stan hiperlipidemii powoduje nie tylko zaburzenia dotyczące lipoprotein osocza, ale także upośledza czynność różnorodnych komórek [22, 23]. W środowisku bogatym w cholesterol w warunkach in vitro obserwowano zmniejszenie płynności błon erytrocytów, głównie na skutek zwiększenia stężenia cholesterolu błonowego oraz zmian w zawartości i rozmieszczeniu fosfolipidów [23]. W przeprowadzonym przez autorów niniejszej pracy badaniu w błonach erytrocytarnych pacjentek z ZM w okresie menopauzy, bez klinicznych objawów miażdżycy stwierdzono, w odniesieniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej, istotne zwiększenie stężenia cholesterolu błonowego oraz zmniejszoną aktywność ATP-azy-Na+/K+. Anichkov i wsp. zaobserwowali w grupie kobiet z ZM (średnia wieku 45 ±6 lat) zmiany w strukturze błony erytrocytarnej. Za pomocą rezonansu paramagnetycznego oznaczono parametr uporządkowania s, którego wartość wskazywała na zmniejszoną płynność błony w porównaniu z grupą kontrolną [24].
Lijnen i wsp. badali zależności pomiędzy transportem błonowym w krwinkach czerwonych, budową błony plazmatycznej a stężeniem lipidów w osoczu, białek osoczowych i mikroalbuminurią u chorych na cukrzycę insulinozależną. Wykazano większą zawartość cholesterolu błonowego, niższą zawartość fosfolipidów oraz zahamowanie aktywności ATP-azy-Na+/K+ [25]. Wyniki te zostały potwierdzone w warunkach in vitro. Erytrocyty ludzkie uzyskane od zdrowych osobników były inkubowane w zawiesinie wzbogaconej w cholesterol i lecytynę. Po 16 godz. inkubacji zawartość cholesterolu w błonach erytrocytarnych wzrosła o 47%. Zaobserwowano również zahamowanie aktywności ATP-azy-Na+/K+ [26].
Prawdopodobne jest, że statyny, poprzez korzystny wpływ na profil lipidowy osocza oraz szeroko pojęte działanie plejotropowe, w tym antyoksydacyjne, mogą zmieniać strukturę błon plazmatycznych erytrocytów, która została zaburzona w warunkach dyslipidemii [23, 27]. W badaniach własnych już po 4 tyg. stosowania atorwastatyny w dawce 10 mg zaobserwowano istotne zmniejszenie zawartości cholesterolu błonowego oraz znaczący wzrost aktywności ATP-azy-Na+/K+. Podobne zmiany aktywności tego enzymu obserwowano po leczeniu simwastatyną i prawastatyną [28]. Niewiele jest prac dotyczących wpływu atorwastatyny na strukturę błon erytrocytów i parametry reologiczne krwi. We wcześniejszych badaniach własnych u chorych na hipercholesterolemię typu II zaobserwowano istotny spadek stężenia cholesterolu błonowego już po 4 tyg. terapii atorwastatyną. Poprawiła się również płynność błony erytrocytu mierzona techniką rezonansu paramagnetycznego [27]. Uważa się, że jednymi z głównych determinantów aktywności ATP-azy-Na+/K+ w warunkach hiperlipidemii jest zawartość cholesterolu błonowego oraz poziom produktów peroksydacji lipidów [29]. Jak wynika z badań własnych, 4-tygodniowa terapia atorwastatyną okazała się wystarczająca do pełnej kompensacji zaburzeń w błonach erytrocytów.
Obecnie uważa się, że wszystkie statyny, bez względu na właściwości farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, zmniejszają stężenie CRP średnio o 15–25% [30]. Singh i wsp. zaobserwowali w grupie chorych na ZM, że dopiero dawka atorwastatyny 80 mg po 12 tyg. leczenia znacząco redukuje poziom CRP (o 40%), natomiast dawka 10 mg jedynie o 17% [31]. Z kolei Ikewaki i wsp. u chorych na hipercholesterolemię po 4 tyg. leczenia atorwastatyną w dawce 10 mg wykazali spadek stężenia CRP o 15% [32]. W naszych badaniach po 12 tyg. terapii atorwastatyną w dawce 10 mg poziom hsCRP obniżył się o 30%.

Wnioski
1. Po 4 tyg. terapii atorwastatyną stwierdzono istotne zmniejszenie stężenia TC, cholesterolu frakcji LDL, TG, cholesterolu błonowego w erytrocytach kobiet w okresie menopauzalnym z zespołem metabolicznym w odniesieniu do wartości przed leczeniem.
2. Średnia wartość hsCRP uległa istotnemu obniżeniu po 12 tyg. terapii w stosunku do wartości przed leczeniem.
3. Średnie wartości masy ciała, obwodu pasa, BMI, TG i hsCRP po 12 tyg. leczenia atorwastatyną były nadal istotnie wyższe niż wartości w grupie kontrolnej.
4. Stwierdzono istotny wzrost aktywności ATP-azy-Na+/K+ po 12 tyg. terapii.
5. Dwunastotygodniowa terapia atorwastatyną okazała się wystarczająca do pełnej kompensacji zaburzeń w strukturze błon erytrocytów.

Piśmiennictwo
1. Grundy SM, Cleeman J, Daniels SR, et al. Diagnosis and management of the metabolic syndrome: an American Heart Association, National Heart, Lung, and Blood Institute Scientific Statement. Curr Opin Cardiol 2006; 21: 1-6.
2. Mesh VR, Boero LE, Siseles NO, et al. Metabolic syndrome throughout the menopausal transition: influence of age and menopausal status. Climacteric 2006; 9: 40-8.
3. Zhang C, Rexrode KM, van Dam RM, et al. Abdominal obesity and the risk of allcause, cardiovascular, and cancer mortality. Sixteen years of follow-up in US women. Circulation 2008; 117: 1658-67.
4. Kaaja RJ. Metabolic syndrome and the menopause. Menopause International 2008; 14: 21-25.
5. Sowers MF, Zheng H, Tomey K, et al. Changes in body composition in women over six years at midlife: ovarian and chronological aging. J Clin Endocrinol Metab 2007; 92: 895-901.
6. Dandona P, Aljada A, Chaudhuri A, et al. Metabolic syndrome: a comprehensive perspective based on interactions between obesity, diabetes and inflammation. Circulation 2005; 111: 1448-54.
7. Toker S, Rogowski O, Melamed S, et al. Association of components of the metabolic syndrome with the appearance of aggregated red blood cells in the peripheral blood. An unfavorable hemorheological finding. Diabetes Metab Res Rev 2005; 21: 197-202.
8. Contreras T, Vaya A, Palanca S, et al. Influence of plasmatic lipids on the hemorheological profile in healthy adults. Clin Hemorheol Microcirc 2004; 30: 423-5.
9. Faloia E, Garrapa GG, Martarelli D, et al. Physicochemical and functional modifications induced by obesity on human erythrocyte membranes. Eur J Clin Invest 1999; 29: 432-67.
10. Pasterkamp G, Virmani R. The erythrocyte: a new player in atheromatous core formation. Heart 2002; 88: 115-6.
11. Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults: Executive Summary of the third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP), expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). J Am Med Ass 2001; 285: 2486-97.
12. Dodge JT, Mitchell C, Hanahan DJ. The preparation and chemical characteristics of haemoglobin – free ghost of human erythrocytes. Arch Biochem Biophys 1963; 100: 119-30.
13. Rodriguez-Vico F, Martinez-Cayuela M, Zafra MF, et al. A procedure for the simultaneous determination of lipid and protein in biomembranes and other biological samples. Lipids 1991; 26: 77-80.
14. Kłyszejko-Stefanowicz L. Cytobiochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1995.
15. Bartosz G, Bartosz M, Sokal A, et al. Stimulation of erythrocyte membrane Mg+2ATPase activity by dinitrophenol and other membrane disturbing agents. Biochem Mol Biol Int 1994; 34: 521-9.
16. Stevenson JC, Crook D, Godsland IF. Influence of age and menopause on serum lipids and lipoproteins in healthy women. Atherosclerosis 1993; 98: 83-90.
17. Matthews KA, Meilahn E, Kuller LH, et al. Menopause and risk factors for coronary heart disease. N Engl J Med 1989; 321: 641-6.
18. Kannel WB, Wilson PW. Risk factors that attenuate the female coronary disease disadvantage. Arch Intern Med 1995; 155: 57-61.
19. Hall G, Collins A, Csemiczky G, et al. Lipoproteins and BMI: a comparison between women during transition to menopause and regularly menstruating healthy women. Maturitas 2002; 41: 177-85.
20. Luc G, Bard JM, Arveiler D, et al.; PRIME Study Group. Lipoprotein (a) as a predictor of coronary heart disease: the PRIME Study. Atherosclerosis 2002; 163: 377-84.
21. Koter M, Franiak I, Broncel M, et al. Effect of simvastatin and pravastatin on peroxidation of erythrocyte plasma membrane lipids in patients with type 2 hypercholesterolemia. Can J Physiol Pharmacol 2003; 81: 1-8.
22. Koter M, Franiak I, Strychalska K, et al. Damage to the structure of erythrocyte plasma membranes in patients with type 2 hyper-cholesterolemia. Int J Biochem Cell Biol 2004; 36: 205-15.
23. Kanakaraj P, Singh M. Influence of hypercholesterolemia on morphological and rheological characteristics of erythrocytes. Atherosclerosis 1989; 76: 209-18.
24. Anichkov DA, Maksina AG, Shostak NA. Relationships between erythrocyte membrane properties and components of metabolic syndrome in women. Med Sci Monit 2005; 11: CR203-10.
25. Lijnen P, Fenyvesi A. Transmembrane cationic fluxes in erythrocytes of diabetics and normal men. Methods Find Exp Clin Pharmacol 1994; 16: 37-47.
26. Lijnen P, Petrov V. Cholesterol modulation of transmembrane cation transport systems in human erythrocytes. Biochem Mol Med 1995; 56: 52-62.
27. Koter M, Broncel M, Chojnowska-Jezierska J, et al. The effect of atorvastatin on erythrocyte membranes and serum lipids in patients with type 2 hypercholesterolemia. Eur J Clin Pharmacol 2002; 58: 501-6.
28. Rabini RA, Polenta M, Staffolani R, et al. Effect of hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitors on the functional properties of erythrocyte membranes. Exp Mol Pathol 1993; 59: 51-7.
29. Lijnen P, Celis H, Fagard R. Influence of cholesterol lowering on plasma membrane lipids and cationic transport systems. J Hypertens 1994; 12: 59-64.
30. Jialal I, Stein D, Balis D, et al. Effect of hydroxymethyl glutaryl coenzyme a reductase inhibitor therapy on high sensitive C-reactive protein levels. Circulation 2001; 103: 1933-5.
31. Singh U, Devaraj S, Jialal I, et al. Comparison effect of atorvastatin (10 versus 80 mg) on biomarkers of inflammation and oxidative stress in subjects with metabolic syndrome. Am J Cardiol 2008; 102: 321-5.
32. Ikewaki K, Terao Y, Ozase H, et al. Effects of atorvastatin on nuclear magnetic resonanse – defined lipoprotein subclasses and inflammatory markers in patients with hypercholesterolemia. J Atheroscler Thromb 2009; 16: 51-6.