facebook
eISSN: 2084-9893
ISSN: 0033-2526
Dermatology Review/Przegląd Dermatologiczny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Special Issues Editorial board Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank
5/2010
vol. 97
 
Share:
Share:
Original paper

Vitamin D receptor and methylenetetrahydrofolate reductase expression in skin basal cell carcinomas

Aleksandra Lesiak
,
Karolina Wódz-Naśkiewicz
,
Rafał Pawliczak
,
Michał Rogowski-Tylman
,
Anna Sysa-Jędrzejowska
,
Michał Sobjanek
,
Adam Włodarkiewicz
,
Joanna Narbutt

Przegl Dermatol 2010, 97, 313–318
Online publish date: 2010/12/03
Article file
- ekspresja receptora.pdf  [0.53 MB]
Get citation
 
 

Wprowadzenie

W ostatnich latach ukazało się wiele prac wskazujących na przeciwnowotworowe właściwości witaminy D związane z jej aktywnością biologiczną i zdolnością do hamowania proliferacji oraz regulacji różnicowania się komórek. Dane z piśmiennictwa wskazują również, że niedobór witaminy D łączy się ze zwiększonym ryzykiem rozwoju niektórych nowotworów narządów wewnętrznych, a także chorób autoimmunologicznych [1]. Połączenie aktywnej formy witaminy D z jej naturalnym ligandem, którym jest receptor dla witaminy D (ang. vitamin D receptor – VDR) nasila apoptozę komórek nowotworowych, a także, jako czynnik transkrypcyjny, reguluje aktywność ponad 60 genów odpowiedzialnych za procesy różnicowania się komórek oraz efekty antyproliferacyjne [2, 3]. W badaniach eksperymentalnych wykazano zwiększoną ekspresję VDR w komórkach m.in. nowotworów piersi, prostaty, trzustki, jelita grubego oraz tarczycy [4, 5]. Zwiększoną ekspresję tego białka stwierdzono ponadto w komórkach niemelanocytowych raków skóry, tj. raków podstawno- (ang. basal cell carcinoma – BCC) oraz kolczystokomórkowych (ang. squamous cell carcinoma – SCC) [6].
Zinser i wsp. [7] w badaniu na modelu zwierzęcym wykazali, że u myszy pozbawionych ekspresji VDR i poddanych działaniu chemicznego kancerogenu w 85% przypadków dochodzi do rozwoju raków skóry, głównie SCC. U zwierząt z prawidłową ekspresją tego receptora rozwój nowotworów obserwowano zaledwie w 17% przypadków. Wyniki tych obserwacji wskazują na istotną rolę VDR w procesie nowotworzenia [7].
Reduktaza metylenotetrahydrofolianowa (ang. methylenetetrahydrofolate reductase – MTHFR) jest enzymem odgrywającym istotną rolę w metabolizmie folianów. Związki te są niezbędne w procesach naprawy DNA ulegającego uszkodzeniu pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Ponadto wykazano, że foliany biorą udział w regulacji porliferacji keratynocytów oraz innych komórek ulegających szybkim podziałom. Substratem dla MTHFR jest białko wewnątrzkomórkowe, 5,10-metylenotetrahydrofolian, który pełni istotną rolę w syntezie i naprawie DNA jądra komórkowego, podczas gdy w osoczu stwierdza się produkt reakcji enzymatycznej – 5-metylenotetrahydrofolian niezbędny do syntezy metioniny i metylacji DNA. Naprawa uszkodzeń DNA jest kluczowym zjawiskiem chroniącym organizm przed rozwojem nowotworów [8–12].
Nieprawidłowa aktywność MTHFR została uznana za jeden z czynników biorących udział w kancerogenezie. W chwili obecnej pojedyncze prace wskazują na udział polimorfizmów w genie kodującym MTHFR w rozwoju niemelanocytowych raków skóry [13].

Cel pracy

Przytoczone powyżej informacje, wskazujące na udział zarówno witaminy D, jak i receptora VDR oraz enzymu MTHFR w patogenezie nowotworów, stanowiły przesłankę do przeprowadzenia badań własnych oceniających stężenie 25(OH)D oraz parat­hormonu w surowicy u pacjentów z BCC, a także poziom ekspresji VDR i MTHFR w bioptatach skóry pobranych od chorych na raka podstawnokomórkowego.

Materiał i metodyka

Badaniem objęto grupę 79 chorych z potwierdzonym histopatologicznie BCC (41 kobiet, 38 mężczyzn, średni wiek 60,2 roku, fototyp skóry: I/II – 20 osób, III – 52 osoby, IV – 7 osób) leczonych w Katedrze i Klinice Dermatologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w latach 2005–2008 oraz 46 wolontariuszy stanowiących grupę kontrolną (21 kobiet, 25 mężczyzn, średni wiek 58,4 roku, fototyp skóry: I/II – 10 osób, III – 28 osób, IV – 8 osób) [14]. Żadna z badanych osób nie była biorcą przeszczepu, nie była leczona lekami immunosupresyjnymi ani nie chorowała na inny nowotwór. U wszystkich badanych oznaczano w miesiącach wczesnowiosennych (kwiecień–maj) stężenie witaminy D i parathormonu w surowicy, natomiast u 44 pacjentów z BCC oraz 30 wolontariuszy pobierano biopsje skóry celem oznaczenia ekspresji VDR i MTHFR. Wycinki pobierano wyłącznie ze zmian typu BCC zlokalizowanych w górnej części policzka. U wolontariuszy pobierano biopsje skóry z analogicznej lokalizacji. Stężenia 25(OH)D i parat­hormonu w surowicy nie oznaczano.

Metoda Western blot

Pobrane bioptaty skóry zostały umieszczone w 0,5 ml buforu lizującego, zawierającego 0,25-procentowy Triton X-100 oraz Complete (inhibitor proteaz, Roche, Szwajcaria). Następnie komórki poddano sonifikacji, trzykrotnie przez 15 sekund, a potem odwirowywano (3 minuty, 14 000 rpm). Do pomiaru stężenia całkowitego białka w lizatach komórek użyto zestawu BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, USA). Próbki zawierające 50 µg białka przed naniesieniem elektroforezą były denaturowane w buforze próbkowym (95°C, 5 minut) zawierającym DDT, a nastepnie rozdzielane w 10% żelu poliakrylamidowym SDS-PAGE, w buforze Tris-glycine SDS. Rozdzielone białka przenoszono w polu elektrycznym na membranę PVDF (Millipore, Billerica, USA). Po transferze membranę blokowano w 5% mleku odtłuszczonym z dodatkiem 0,1% Tween20, w temperaturze 4°C, przez 12 godzin. W celu wykrycia białka zastosowano poliklonalne kozie przeciwciała pierwszorzędowe (SantaCruz Biotechnoloy, Santa Cruz, USA) skierowane swoiście przeciwko ludzkiemu MTHFR (1 : 200) oraz mysie przeciwciała pierwszorzędowe (SantaCruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) skierowane swoiście przeciwko ludzkiemu VDR (1 : 200). Jako przeciwciał drugorzędowych użyto oślich przeciwciał znakowanych HRP (1 : 20000) skierowanych przeciwko kozim IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratory, Suffolk, Wielka Brytania) lub oślich przeciwciał znakowanych HRP (1 : 20000) skierowanych przeciwko mysim (Jackson ImmunoResearch Laboratory Suffolk, Wielka Brytania). W celu uwidocznienia uzyskanych prążków użyto ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Wielka Brytania) oraz system do wizualizacji chemilumi­nescencji ChemiImager™ System (Alpha Innotech, San Leandro, Kanada). Gęstość optyczna (IDV) prążków była analizowana przy użyciu oprogramowania ChemiImager™ Software (Alpha Innotech San Leandro, Kanada).

Oznaczenie stężenia witaminy D i parathormonu

Surowica przechowywana była w temperaturze –25°C do chwili przeprowadzenia oznaczeń. Stężenie witaminy D oznaczano metodą radioimmunoassay (BioSource Europe S.A. Nivelles, Belgium), a parat­hormonu medodą immunochemiluminescencji (IMMULITE Turbointact PTH, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles USA).

Analiza statystyczna

W celu porównań statystycznych, poza obliczeniem średniej arytmetycznej i odchylenia standardowego, posłużono się obliczeniem mediany, dolnego i górnego kwartyla, wartości minimum i maksimum. Do oceny istotności różnic badanych parametrów pomiędzy dwoma grupami zastosowano test U Manna-Whitneya. Dla wszystkich porównań i korelacji istotność statystyczną uznawano przy p < 0,05.

Wyniki

Stężenie 25(OH)D było statystycznie istotnie wyższe w grupie kontrolnej niż u chorych na BCC (mediana 29,5 ng/ml vs mediana 24,2 ng/ml, p = 0,0026). U 28 (35,4%) spośród 79 chorych na BCC stężenie witaminy D było poniżej wartosci 20 ng/ml, u 30 (38%) chorych było w granicach 20–30 ng/ml, podczas gdy u pozostałych 21 (26,6%) osób poziom był wyższy od 30 ng/ml. W grupie kontrolnej stężenie 25(OH)D poniżej 20 ng/ml wykazano u 5 (10,9%) osób, u 20 (43,5%) było pomiędzy 20 ng/ml a 30 ng/ml, natomiast u 21 (45,5%) – powyżej 30 ng/ml (ryc. 1. A). Stężenie parathormonu w surowicy u pacjentów z BCC było istotnie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (56,05 pg/ml vs 32,7 pg/ml, p < 0,0001) (ryc. 1. B).
We wszystkich analizowanych bioptatach wykazano ekspresję VDR. U chorych na BCC była ona istotnie wyższa niż w grupie kontrolnej (mediana 1,4 × 106 IDV vs mediana 0,4 × 106 IDV, p < 0,001). Taką samą zależność obserwowano w odniesieniu do ekspresji MTHFR, która była istotnie wyższa w bioptatach skóry pobranych ze zmian typu BCC w porównaniu z grupą kontrolną (mediana 7,9 × × 106 IDV vs mediana 5,3 × 106 IDV, p < 0,01) (tab. I, ryc. 2. i 3.).

Omówienie

Kalcytriol ma swoje receptory nie tylko w kościach, ale również w innych tkankach, między innymi w komórkach układu immunologicznego, krwiotwórczego, skóry, w mięśniach oraz komórkach różnych nowotworów, np. czerniaka. Aktywna postać witaminy D działa w nich jako czynnik antyproliferacyjny oraz proróżnicujący [15, 16]. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano związki pomiędzy niedoborem witaminy D a rozwojem pewnych chorób, do których należą m.in. niektóre nowotwory (np. rak piersi, trzustki, jelita grubego), cukrzyca typu 2, choroby autoimmunologiczne, choroba niedokrwienna serca czy nadciśnienie tętnicze [17, 18]. W ostatnio opublikowanej pracy Asgari i wsp. [19] wykazali związek pomiędzy zwiększonym ryzykiem rozwoju BCC a wysokim stężeniem witamny D w okresie poprzedzającym rozpoznanie nowotworu o 11 lat. Oceniając ryzyko rozwoju BCC, autorzy stwierdzili, że podwyższenie stężenia wita­miny D o 1 ng/ml zwiększało to ryzyko o 2%. Przeciwne wyniki uzyskano w badaniach przeprowadzonych w warunkach in vitro, w których wykazano zahamowanie wzrostu BCC pod wpływem wysokich stężeń witaminy D [20]. Van Dam i wsp. oraz Gandini i wsp. nie wykazali także związku pomiędzy rozwojem raków kolczystokomórkowych a spożyciem witaminy D w codziennej diecie [21, 22].
W badaniu własnym oceniano stężenie 25-hydro­ksycholekalcyferolu w surowicy chorych na BCC, ponieważ stężenie tego związku odpowiada rzeczywistemu zaopatrzeniu organizmu w witaminę D. Ponadto, zgodnie z danymi z piśmiennictwa, jego ocena przewyższa pomiary innych form [23, 24]. Uzyskane w pracy własnej stężenie 25(OH)D było istotnie niższe u chorych na BCC niż w grupie kontrolnej, jednak u większości osób z obu grup stwierdzono stężenie poniżej 30 ng/ml. Obserwacja ta wymaga jednak ostrożnej interpretacji ze względu na przewagę pacjentów starszych wiekowo, u których najczęściej stwierdza się tendencję do występowania niedoborów witaminy D [25]. Mimo to statystycznie istotna różnica pomiędzy badanymi grupami może sugerować, że niedobór witaminy D jest jednym z czynników odgrywających rolę w rozwoju raków podstawnokomórkowych. Ze względu na brak dostępnych w ogólnoświatowym piśmiennictwie danych analizujących stężenie 25(OH)D w surowicy u chorych z już rozwiniętym BCC w porównaniu z grupą kontrolną, dobraną pod względem wieku, płci i fototypu skóry, prezentowane wyniki własne wydają się interesujące i są przesłanką do prowadzenie dalszych badań. Miałyby one na celu ocenę stężenia witaminy D u pacjentów z BCC i jego związku z ryzykiem ujawnienia się zmian nowotworowych. Obniżone stężenie 25(OH)D z równoczesnym wzrostem stężenia parat­hormonu może również przemawiać za udziałem tej wita­miny w złożonym procesie skórnej kancerogenezy.
Reichrath i wsp. [26] wykazali, że ekspresja receptora VDR, a także ekspresja jego mRNA, jest istotnie silniejsza w wycinkach pobranych ze zmian typu BCC niż w skórze pozornie zdrowej, pobranej z okolicy zmian chorobowych, bądź w skórze zdrowej pobranej od osób z grupy kontrolnej. Autorzy na podstawie przeprowadzonych obserwacji zasugerowali, że nasilona ekspresja VDR jest związana z procesami regulacji wzrostu BCC. Uzyskane wyniki własne są zgodne z obserwacjami Reichratha i wsp. [26], wykazano w nich również istotny wzrost ekspresji VDR w bioptatach pobranych z ognisk BCC w porównaniu z osobami zdrowymi. Na podstawie dostępnej wiedzy nie jest obecnie możliwe ustalenie, czy nasilona ekspresja tego receptora ma związek ze zdolnością syntezy kalcytriolu z witaminy D przez raki podstawnokomórkowe. Sugeruje się, że nasilona ekspresja VDR może być związana z obecnością polimorfizmów w genie kodującym VDR, które stwierdza się u chorych na BCC, co funkcjonalnie wiąże się z syntezą częściowo nieaktywnej formy białka, które nie ma zdolności wiązania się z ligandem. Uznaje się, że nasilona ekspresja receptora, mimo upośledzenia jego funkcji, jest mechanizmem protekcyjnym. Hipoteza ta nazwana została przez Reichratha i wsp. sprzężeniem zwrotnym [27]. Również w rakach kolczystokomórkowych obserwowano nasiloną ekspresję receptora VDR [28]. Nie stwierdzono jednak korelacji pomiędzy tym parametrem a histopatologicznym typem ani stopniem złośliwości SCC. Obserwowano, że inkubacja linii komórkowych wywodzących się z SCC z kalcytriolem prowadziła do supresji proliferacji komórek, co jest pośrednim dowodem na rolę VDR w patogenezie SCC oraz stanowi przesłankę do testowania analogów witaminy D w terapii niemelanocytowych raków skóry. Na podstawie przeprowadzonych badań podobne wnioski wysunęli Kamradt i wsp. [29], którzy wykazali istotną rolę witaminy D w patogenezie SCC i BCC.
Podsumowując dane z literatury i wyniki badań własnych, nie można jednoznacznie określić roli VDR i MTHFR w rozwoju raków podstawnokomórkowych skóry, jakkolwiek wiele argumentów przemawia za ich istotnym udziałem w procesie kancerogenezy. Stąd wydaje się, że niezwykle potrzebne i uzasadnione jest prowadzenie dalszych, kompleksowych i wieloośrodkowych badań celem poznania złożonej etiopatogenezy BCC.


Praca finansowana z funduszu prac statutowych UM w Łodzi nr 503-1152-1 oraz projektu MNiSW nr NN402474731.

Piśmiennictwo

 1. Holick M.F.: Vitamin D: the underappreciated D-lightful hormone that is important for skeletal and cellular health. Curr Opin Endocrinol Diabetes 2002, 9, 87-98.  
2. Raimondi S., Johansson H., Maisonneuve P., Gandini S.: Review and meta-analysis on vitamin D receptor polymorphisms and cancer risk. Carcinogenesis 2009, 30, 1170-1180.  
3. Schwartz G.G., Hall M.C., Stindt D., Patton S., Lovato J., Torti F.: Phase I/II study of 19-nor-1alpha-25-dihydroxyvitamin D2 (paricalcitol) in advanced, androgen-insensitive prostate cancer. Clin Cancer Res 2005, 11, 8680-8685.  
4. Bouillon R., Eelen G., Verlinden L., Mathieu C., Carmeliet G., Verstuyf A.: Vitamin D and cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 2006 , 102, 156-162.  
5. Köstner K., Denzer N., Müller C.S., Klein R., Tilgen W., Reichrath J.: The relevance of vitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms for cancer: a review of the literature. Anticancer Res 2009, 29, 3511-3536.  
6. Bikle D.D.: Vitamin D receptor, UVR and skin cancer: a potential protective mechanism. J Ivest Dermatol 2008, 128, 2357-2361.  
7. Zinser G.M., Sundberg J.P., Welsh J.: Vitamin D(3) receptor ablation sensitizes skin to chemically induced tumorigenesis. Carcinogenesis 2002, 23, 2103-2109.  
8. Larsson S.C., Giovannucci E., Wolk A.: Folate intake, MTHFR polymorphisms, and risk of esophageal, gastric, and pancreatic cancer: a meta-analysis. Gastroenterology 2006, 131, 1271-1283.  
9. Blount B.C., Mack M.M., Wehr C.M., MacGregor J.T., Hiatt R.A., Wang G. i inni.: Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DNA and chromosome breakage: implications for cancer and neuronal damage. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, 3290-3295.
10. Choi S.W., Kim Y.I., Weitzel J.N., Mason J.B.: Folate depletion impairs DNA excision repair in the colon of the rat. Gut 1998, 43, 93-99.
11. Branda R.F., Blickensderfer D.B.: Folate deficiency increases genetic damage caused by alkylating agents and gamma-irradiation in Chinese hamster ovary cells. Cancer Res 1993, 53, 5401-5408.
12. Wei Q., Shen H., Wang L.E., Duphorne C.M., Pillow P.C., Guo Z. i inni: Association between low dietary folate intake and suboptimal cellular DNA repair capacity. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003, 12, 963-969.
13. Laing M.E., Dicker P., Moloney F.J., Ho W.L., Murphy G.M., Conlon P. i inni: Association of methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism and the risk of squamous cell carcinoma in renal transplant patients Transplantation 2007,15, 113-116.
14. Fitzpatrick T.B.: The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Arch Dermatol 1988, 124, 869-871.
15. Grant W.B., Strange R.C., Garland C.F.: Sunshine is good medicine. The health benefits of ultraviolet-B induced vitamin D production. J Cosmet Dermatol 2004, 2, 86-98.
16. Lehmann B., Querings K., Reichrath J.: New relevance of vitamin D3 metabolism in the skin. Hautarzt 2004, 55, 446-452.
17. Ortlepp J.R., Lauscher J., Hoffmann R., Hanrath P., Joost H.G.: The vitamin D receptor gene variant is associated with the prevalence of type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease. Diabet Med 2001, 18, 842-845.
18. Barthel H.R., Scharla S.H.: Benefits beyond the bones- vitamin D against falls, cancer, hypertension and autoimmune diseases. Dtsch Med Wochenschr 2003, 128, 440-446.
19. Asgari M.M., Tang J., Warton M.E., Chren M.M., Quesenberry C.P. Jr, Bikle D., Horst R.L. i inni: Association of prediagnostic serum vitamin D levels with the development of basal cell carcinoma. J Invest Dermatol 2010, 130, 1438-1443.
20. Xiao T.Z., Tang J.Y, Wu A., Shpall E., Khaimsky I., So P. i inni: Hedgehog signaling of BCC is inhibited by vitamin D: implication for a chemopreventive agent against BCC carcinogenesis. J Invest Dermatol 2009, 129, S32.
21. Van Dam R.M., Huang Z., Giovannucci E., Rimm E.B., Hunter D.J., Colditz G.A. i inni: Diet and basal cell carcinoma of the skin in a prospective cohort of men. Am J Clin Nutr 2000, 71, 135-141.
22. Gandini S., Raimondi S., Gnagnarella P., Doré J.F., Maisonneuve P., Testori A.: Vitamin D and skin cancer: a meta-analysis. Eur J Cancer 2009, 45, 634-641.
23. Holick M.F.: The use and interpretation of assays for vitamin D and its metabolites. J Nutr 1990, 120 (Suppl. 11), 1464-1469.
24. Millen A.E., Bodnar L.M.: Assessment of vitamin D in population-based studies. Am J Clin Nutr 2008, 87, 1079S.
25. Holick M.F.: Vitamin D: the underappreciated D-lightful hormone that is important for skeletal and cellular health. Curr Opin Endocrinol Diabetes 2002, 9, 87-98.
26. Reichrath J., Kamradt J., Zhu X.H., Kong X.F., Tilgen W., Holick M.F.: Analysis of 1,25- dihydroxyvitamin D3 receptors VDR in basall carcinoma. Am J Pathol 1999, 155, 583-589.
27. Reichrath J., Kamradt J., Zhu X.H., Kong X.F., Tilgen W., Holick M.F.: Analysis of 1,25- dihydroxyvitamin D3 receptors (VDR) in basal cell carcinoma. Am J Pathol 1999, 155, 583-589.
28. Reichrath J., Rafi L., Rech M., Mitschele T., Meineke V., Gärtner B.C. i inni: Analysis of the vitamin D system in cutaneous squamous cell carcinomas. J Cutan Pathol 2004, 31, 224-231.
29. Kamradt J., Rafi L., Mitschele T., Meineke V., Gärtner B.C., Wolfgang T., i inni: Analysis of the vitamin D system in cutaneous malignancies. Recent results. Cancer Res 2003, 164, 259-269.




Otrzymano : 21 IX 2010 r.
Zaakceptowano : 29 IX 2010 r.
Copyright: © 2010 Polish Dermatological Association. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.


Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.