c-myc oncogene aberration in breast cancer patients assessed by direct double differential PCR

Wstęp
Zachorowania na raka piersi stanowią ok. 20% zachorowań na wszystkie nowotwory u kobiet, przy czym w Polsce z powodu tej choroby umiera ok. 5 tys. kobiet, a diagnozowanych jest ok. 12 tys. nowych przypadków rocznie [1]. Etiologia choroby nie jest do końca poznana. Rak piersi należy do nowotworów heterogennych, a ścieżki jego inicjacji i progresji są zróżnicowane [2]. Przekłada się to na trudności w ocenie rokowania. Okazuje się bowiem, że pacjenci, u których określono fenotyp raka jako sprzyjający, mają krótki czas przeżycia (OS – overall survival) i czas do wznowy (DFS – disease free survival). Do wielu czynników, które zwiększają ryzyko zachorowania i mogą wpłynąć na przebieg choroby, zaliczane są m.in. czynniki genetyczne. Wśród nich szczególną uwagę zwraca gen c-myc zlokalizowany w obrębie długiego ramienia chromosomu 8. (8q24). Białko c-Myc jest czynnikiem transkrypcyjnym, będącym jednym z kluczowych regulatorów cyklu komórkowego. Jego rola polega głównie na promocji przejścia komórki z fazy G1 do S [3]. Dodatkowo c-Myc aktywuje transkrypcję genów zaangażowanych w procesy, takie jak wzrost, apoptoza, transformacja, angiogeneza, immortalizacja. Genami docelowymi dla c-Myc są również geny różnicowania i adhezji, dla których jest on represorem [4–6]. Aktywność c-myc jest ściśle regulowana na poziomie transkrypcyjnym, posttranskrypcyjnym, translacyjnym i posttranslacyjnym [7]. Wszelkie zaburzenia tej regulacji prowadzą do zaburzenia ekspresji genu. Dotychczas opisano kilka mechanizmów prowadzących do aktywacji onkogenu c-myc w ludzkich nowotworach. Należą do nich translokacje genu na chromosomy 2., 14. lub 22., amplifikacje genu, mutacje punktowe w allelach c-myc ulegających translokacji oraz zaburzenia dotyczące regulatorów ekspresji c-myc [6]. Wykazano również, że zwiększona ekspresja białka c-Myc oraz podwyższona ilość mRNA tego białka jest ściśle skorelowana z występowaniem jego amplifikacji [8]. Wyniki części badań wskazują, że c-myc może być markerem prognostycznym w raku piersi, co pozwoliłoby w takich wypadkach wyodrębnić grupę pacjentów z gorszym rokowaniem, dlatego w niniejszej pracy zbadano liczbę kopii onkogenu c-myc. Wykorzystano technikę dddPCR [9, 10], która jako metoda łatwa, szybka i wiarygodna może stanowić alternatywę dla żmudnych i drogich badań diagnostycznych z wykorzystaniem innych narzędzi biologii molekularnej.

Materiał i metody
Materiał kliniczny
Materiał kliniczny stanowił DNA wyizolowany przy użyciu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) z 138 guzów nowotworowych pochodzących wyłącznie od kobiet. 79 chorych leczonych było w Centrum Onkologii – Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie w Warszawie, natomiast 59 – w Regionalnym Centrum Onkologii w Bydgoszczy. Pacjentki były leczone w wyżej wymienionych ośrodkach pomiędzy 1998 i 2003 r. Ich wiek zawierał się w przedziale 34–85 lat, średnia wynosiła 57 lat. Charakterystyka ogólna chorych przestawiona jest w tab. 1.

dddPCR
Zastosowano startery o następujących sekwencjach: geny referencyjne – HBB F: 5’-GCA CTG ACT CTC TCT GCC TAT TGG-3’, HBB R: 5’-GAT CCA CGT GCA GCT TGT CAC AG-3’, SOD2 F: 5’-GAG AAG CTG ACG GCT GCA TCT GTT G-3’, SOD2 R: 5’-AGC AAT TTG TAA GTG TCC CCG TTC C-3’ oraz gen badany c-MYC F: 5’-GGA CTA TCC TGC TGC CAA GAG GG-3’, c-MYC R: 5’-CAT TCT CCT CGG TGT CCG AGG ACC-3’ [9]. Reakcję PCR przeprowadzano w objętości 50 µl z użyciem odczynników w następujących stężeniach: 1 x stęż. PCR bufor (w tym MgCl2 o stężeniu 1,5 mM), 200 µmol dNTP, 1 jednostka polimerazy HotStart Taq (Roche), 20 pmol każdego ze starterów oraz ok. 200 ng matrycy DNA. Reakcja PCR była prowadzona przy zastosowaniu następującego profilu temperaturowego:
• wstępna denaturacja w temp. 95°C przez 15 min,
• 30 cykli: denaturacja w temp. 94°C przez 1 min, hybrydyzacja w temp. 62°C przez 1 min oraz
• elongacja w temp. 72°C przez 1 min 10 s, a następnie
• 1 cykl: denaturacja w temp. 94°C przez 1 min, hybrydyzacja w temp. 62°C przez 1 min oraz
• elongacja końcowa w temp. 72°C przez 8 min.

Wszystkie pomiary wykonane zostały przynajmniej 2-krotnie. Kontrola negatywna nie zawierała DNA.

Elektroforeza w żelu agarozowym i analiza densytometryczna
Elektroforeza prowadzona była przez 2,5 godz. w 3% żelu agarozowym, w 1 x stęż. TBE, przy napięciu ok. 5 V na 1 cm odległości pomiędzy elektrodami. Żel wybarwiono następnie w roztworze bromku etydyny o stężeniu 0,5 mg/ml. W celu uwidocznienia prążków zastosowano promieniowanie UV o długości fali 302 nm. Porównanie intensywności prążków wykonano przy pomocy sytemu GelDoc 2000™. Aby określić liczbę kopii genu c-myc w danej próbce wyznaczono najpierw hipotetyczną wartość intensywności charakterystyczną dla pojedynczej kopii genu (c-myc_{single copy gene}) wg wzoru: A _{c-myc single – copy gene} = (L_c-myc – L_HBB)/(L_HBB – L_SOD2) x x (A_HBB – A_SOD2) + A_HBB,

gdzie L oznaczało długość poszczególnych amplikonów podaną w parach zasad, a A intensywność poszczególnych prążków podaną w jednostkach względnych. Porównując obserwowaną wartość intensywności fluorescencji dla prążka c-myc w danej próbce z wyznaczoną wartością hipotetyczną otrzymano wartość określaną jako AGCN (average gene copy number), czyli średnią liczbę kopii badanego genu, obliczaną wg wzoru: AGCN = A _c–myc/A _{c-myc single copy gene} [9–10]

Analiza statystyczna
Dane analizowano za pomocą nieparametrycznych testów: testu wariancji Manna-Whitneya i testu niezależności χ². Dla wartości p<0,05 wyniki uznano za statystycznie istotne.

Wyniki
W celu wyznaczenia, jakie wartości AGCN są statystycznie różne od 1, wykonano 3 razy 8-krotny pomiar dla tej samej próbki zdrowego DNA leukocytarnego. Średnia z uzyskanych w ten sposób odchyleń standardowych wyników wynosiła 0,17. Różnicę krytyczną (d_k), która pozwala określić, kiedy wyniki różnią się w sposób istotny statystycznie, wyliczono ze wzoru d_k = 2 ´ Sd ´ √2. W przypadku opisywanych badań różnica krytyczna wynosiła 0,5, w związku z czym przyjęto, że c-myc występuje w komórkach w pojedynczej kopii, gdy obliczona wartość AGCN zawiera się w przedziale od 0,5 do 1,5. Wartość AGCN większa od 1,5 oznacza amplifikację, a mniejsza od 0,5 – delecję. Optymalizacja dotyczyła konkretnych warunków, w których prowadzone były badania.
Przykład analizy przedstawiono na ryc. 1.

Amplifikację stwierdzono w 20 spośród 138 analizowanych próbek (14,5%). Wartość AGCN dla próbek, w których stwierdzono amplifikację (AGCN >1,5) zawiera się w przedziale 1,51–2,94. Delecji (AGCN <0,5) nie stwierdzono w żadnym z analizowanych przypadków. Wartość AGCN dla 118 pacjentek zawierała się w przedziale 0,5–1,5, czyli wskazywała na normalną (pojedynczą) liczbę kopii onkogenu c-myc. Średnia wartości AGCN dla wszystkich 138 próbek wynosiła 1,21, mediana – 1,17, natomiast dominanta – 1,14. Na podstawie przeprowadzonego nieparametrycznego testu wariancji Manna-Whitneya stwierdzono, że jedynie w odniesieniu do statusu nowotworu istnieje związek z medianą wartości AGCN, która przyjmuje wartości mniejsze, jeżeli średnica guza jest większa (p<0,05). Dla pozostałych parametrów klinicznych (status węzłów chłonnych, status receptorów estrogenowych oraz progesteronowych, typ nowotworu oraz jego stopień zróżnicowania histologicznego) nie stwierdzono istnienia zależności z odpowiadającymi im wartościami AGCN (p>0,05). W celu sprawdzenia, czy istnieje związek pomiędzy występowaniem amplifikacji i innymi cechami klinicznymi nowotworu, wykonano test niezależności χ². Test ten pozwala na stwierdzenie, czy istnieje zależność pomiędzy cechami jakościowymi dwóch populacji. Istnienia takiej statystycznie istotnej zależności nie stwierdzono. Uwagę zwraca wartość p dla zależności amplifikacji oraz typu histologicznego nowotworu (p=0,088). Nie jest to zależność istotna statystycznie, ale wskazuje ona pewien trend, polegający na występowaniu amplifikacji częściej w rakach przewodowych. Stosunkowo niewielka wartość może być jednak spowodowana mniejszą liczbą analizowanych przypadków raka zrazikowego.

Omówienie wyników
Częstość amplifikacji określona w niniejszej pracy przy pomocy techniki dddPCR (14,5%) jest zgodna z danymi literaturowymi, w których częstość amplifikacji wynosi od 1 do 94%, a średnio – 15,5% [11–13]. Dane uzyskane w niniejszej pracy są zbliżone do wyników uzyskanych przy pomocy innych typów PCR przez innych badaczy, gdzie częstość wykrywania amplifikacji przy pomocy dPCR oraz ddPCR wynosiła odpowiednio 21,5% [14] oraz 25% [15]. Szczególnie istotna jest zgodność z wynikami uzyskanymi bardzo czułą i wiarygodną, aczkolwiek kosztowną i czasochłonną metodą FISH, gdzie częstość wykrywania amplifikacji wynosiła 9%, 13% czy 14,6% [16–18].
W celu sprawdzenia, czy istnieje zależność pomiędzy wartością AGCN oraz amplifikacją genu c-myc a innymi parametrami klinicznymi, przeprowadzono analizę statystyczną uwzględniającą testy nieparametryczne Manna-Whitneya i χ². Wśród badanych parametrów klinicznych znalazły się: status nowotworu (wielkość guza), stan węzłów chłonnych, obecność receptorów steroidowych, typ histologiczny nowotworu, stopień dojrzałości histopatologicznej. Stwierdzono istnienie odwrotnej korelacji pomiędzy wartością AGCN oraz statusem nowotworu. Mediana wartości AGCN była wyższa dla nowotworów o mniejszej średnicy. Pewien trend w kierunku istotności statycznej obserwowano także w odniesieniu do zależności pomiędzy amplifikacją genu c-myc oraz typem nowotworu. Amplifikacja onkogenu pojawiała się częściej w przypadku raków przewodowych.
W danych literaturowych nie ma zgodności, co do zależności pomiędzy aberracjami onkogenu c-myc a innymi cechami klinicznymi, co wynika z faktu, że badania nad rolą onkogenu c-myc w kancerogenezie są utrudnione ze względu na złożoność mechanizmów regulacji i działania protoonkogenu c-myc. Chrzan i wsp. nie stwierdzili powiązania amplifikacji genu c-myc ze średnicą nowotworu, występowaniem lokalnych przerzutów, obecnością receptorów steroidowych oraz dojrzałością histopatologiczną. Zaobserwowali ponadto podobną do uzyskanej w niniejszej pracy częstość amplifikacji w rakach przewodowych i zrazikowych [19]. Podobnie Aulman i wsp. wykluczyli związek pomiędzy amplifikacją genu c-myc oraz statusem receptorów estrogenowych i progesteronowych. Natomiast zaobserwowali korelację ze średnicą guza [20]. Z kolei Berns i wsp. znaleźli korelację pomiędzy amplifikacją i zajęciem węzłów chłonnych [21]. Są także badania potwierdzające związek amplifikacji z negatywnym statusem receptora estrogenowego [15] lub progesteronowego [22]. Naidu i wsp. zaobserwowali dodatkowo korelację z wysoką dojrzałością histopatologiczną [15]. Brak jednoznaczności w wynikach przytoczonych badań dotyczących korelacji amplifikacji z innymi cechami klinicznymi wskazuje, że gen c-myc może być niezależnym markerem prognostycznym, a także sugeruje konieczność dalszych badań na większej populacji chorych, z uwzględnieniem różnych parametrów klinicznych i molekularnych. W niniejszej pracy niemożliwe było, np. dokonanie weryfikacji wartości prognostycznej amplifikacji onkogenu c-myc, tzn. oceny wpływu amplifikacji na czas przeżycia lub ryzyko wznowy. Taka analiza wymaga bowiem wielu lat śledzenia historii choroby pacjentek. Dobrym przykładem tego typu analizy są obserwacje Schlottera i wsp., którzy stwierdzili, że w grupie badanych chorych (brak przerzutów do węzłów chłonnych, brak wspomagającej terapii systemowej), OS i DFS były krótsze, jeżeli dochodziło do amplifikacji genu c-myc [14].
Mimo że w badanej populacji chorych na raka piersi nie dowiedziono związku amplifikacji genu c-myc z klinicznym obrazem choroby, wykazano, iż dddPCR jest szybkim i tanim testem o potencjale diagnostycznym w wykrywaniu zmiany liczby kopii genów.

Praca sfinansowana z grantu Uniwersytetu Gdańskiego nr B051-5-0058-6 (KPB) oraz ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Unii Europejskiej oraz budżetu państwa w związku z realizacją projektu nr Z/2.22/II/2.6/005/05 (NB).

Piśmiennictwo
1. Wojciechowska U, Didkowska J, Tarkowski W, Zatoński W. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2002 roku. Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Warszawa 2004.
2. Schmitt FC, Reis-Filho JS. c-myc, not her-2/neu, can predict the prognosis of breast cancer patients: how novel, how accurate, and how significant? Breast Cancer Res 2003; 5: 188-91.
3. Heikkila R, Schwab G, Wickstrom E, Loke SL, Pluznik DH, Watt R, Neckers LM. A c-myc antisense oligodeoxynucleotide inhibits entry into S phase but not progress from G0 to G1. Nature 1987; 328: 445-9.
4. Dang CV. c-Myc target genes involved in cell growth, apoptosis, and metabolism. Mol Cell Biol 1999; 19: 1-11.
5. Pelengaris S, Khan M. The many faces of c-MYC. Arch Biochem Biophys 2003; 416: 129-36.
6. Ponzielli R, Katz S, Barsyte-Lovejoy D, Penn LZ. Cancer therapeutics: targeting the dark side of Myc. Eur J Cancer 2005; 41: 2485-501.
7. Levens DL. Reconstructing MYC. Genes Dev 2003; 17: 1071-7.
8. Blancato J, Singh B, Liu A, Liao DJ, Dickson RB. Correlation of amplification and overexpression of the c-myc oncogene in high-grade breast cancer: FISH, in situ hybridisation and immunohistochemical analyses. Br J Cancer 2004; 90: 1612-9.
9. Beckmann A, Vogt U, Huda N, Zanker KS, Brandt BH. Direct-double-differential PCR for gene dosage quantification of c-myc. Clin Chem 1999; 5: 141-3.
10. Żaczek A, Welnicka-Jaśkiewicz M, Buerger H, Brandt BH, Bielawski KP. Modified direct-double-differential PCR for gene dosage quantification of HER2, Oncol Rep 2005; 13: 971-5.
11. Ottestad L, Andersen TI, Nesland JM, Skrede M, Tveit KM, Nustad K, Borresen AL. Amplification of c-erbB-2, int-2 and c-myc genes in node-negative breast carcinomas. Relationship to prognosis. Acta Oncol 1993; 32: 289-94.
12. Liao DJ, Dickson RB. c-Myc in breast cancer. Endocr Relat Cancer 2000; 7: 143-64.
13. Rao JY, Apple SK, Jin Y, Lin S; Nieberg RK, Hirtschowitz SL. Comparative polymerase chain reaction analysis of c-myc amplification on archival breast fine-needle aspiration materials. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000; 9: 175-9.
14. Schlotter CM, Vogt U, Bosse U, Mersch B, Wassmann K. c-myc, not HER-2/neu, can predict recurrence and mortality of patients with node-negative breast cancer. Breast Cancer Res 2003; 5: 30-6.
15. Naidu R, Wahab NA, Yadav M, Kutty MK. Protein expression and molecular analysis of c-myc gene in primary breast carcinomas using immunohistochemistry and differential polymerase chain reaction. Int J Mol Med 2002; 9: 189-96.
16. Rummukainen JK, Salminen T, Lundin J, Kytola S, Joensuu H, Isola JJ. Amplification of c-myc by fluorescence in situ hybridization in a population-based breast cancer tissue array. Mod Pathol 2001; 14: 1030-5.
17. Corzo C, Corominas JM, Tusquets I, Salido M, Bellet M, Fabregat X, Serrano S, Sole F. The MYC oncogene in breast cancer progression: from benign epithelium to invasive carcinoma. Cancer Genet Cytogenet 2006; 165: 151-6.
18. Robanus-Maandag EC, Bosch CA, Kristel PM, Hart AA, Faneyte IF; Nederlof PM, Peterse JL, van de Vijver MJ. Association of C-MYC amplification with progression from the in situ to the invasive stage in C-MYC-amplified breast carcinomas. J Pathol 2003; 201: 75-82.
19. Chrzan P, Skokowski J, Karmolinski A, Pawelczyk T. Amplification of c-myc gene and overexpression of c-Myc protein in breast cancer and adjacent non-neoplastic tissue. Clin Biochem 2001; 34: 557-62.
20. Aulmann S, Bentz M, Sinn HP. C-myc oncogene amplification in ductal carcinoma in situ of the breast. Breast Cancer Res Treat 2002; 74: 25-31.
21. Berns EM, Klijn JG, van Putten WL, van Staveren IL, Portengen H, Foekens JA. c-myc amplification is a better prognostic factor than HER2/neu amplification in primary breast cancer. Cancer Res 1992; 52: 1107-13.
22. Cuny M, Kramar A, Courjal F, et al. Relating genotype and phenotype in breast cancer: an analysis of the prognostic significance of amplification at eight different genes or loci and of p53 mutations. Cancer Res 2000; 60: 1077-83.

Adres do korespondencji
dr hab. med. Krzysztof Piotr Bielawski Pracownia Diagnostyki Molekularnej, Katedra Biotechnologii Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG – AMG ul. Kładki 24 80-822 Gdańsk tel. +48 58 523 63 14