60th anniversary of discovery of the LE cell

Wstęp
W 2008 r. minęło 60 lat od odkrycia komórek LE (nazwa od systemic lupus erythematosus – toczeń rumieniowaty układowy, SLE) przez Hargravesa i jego współpracowników – Mortona i Richmond z Mayo Clinic [1–3]. Odkrywcy opisali je jako „dojrzałe granulocyty wielojądrowe, które sfagocytowały materiał jądrowy barwiący się metodą Feulgena”. Obecność komórek LE stwierdzali w preparatach szpiku kostnego, który był wcześniej poddany inkubacji. Odkrycie było „przypadkowe”, gdyż do inkubacji doszło w sposób niezamierzony... Określenie „komórki LE” wprowadzono w związku z obserwacją, iż pojawiały się one wyłącznie w szpiku pochodzącym od chorych, u których podejrzewano lub rozpoznano toczeń rumieniowaty układowy. Nieco później Sundberg i Lich [4] stwierdzili, że do zjawiska LE dochodzi także wtedy, gdy inkubuje się „kożuszek” utworzony przez leukocyty na powierzchni próbki krwi obwodowej pobranej od osób chorych na SLE. Komórki LE powstawały ponadto podczas inkubacji surowicy tych chorych ze szpikiem kostnym pochodzącym od osób bez objawów SLE. Stało się więc jasne, że za ich powstawanie musi być odpowiedzialny czynnik znajdujący się w surowicy. Dalsze badania wykazały, że „czynnik LE” należy do frakcji globulin g, a więc – że są to przeciwciała [5, 6].

Powstawanie komórek LE in vitro
Proces powstawania komórek LE rozpoczyna się od interakcji przeciwciał zawartych w surowicy i jąder komórkowych. Dochodzi do homogenizacji i pęcznienia jąder, które następnie zostają uwolnione z komórek jako „ciałka LE”. W obecności dopełniacza ciałka te są fagocytowane – głównie przez granulocyty – i powstają komórki LE.
Technika wykonania testu mającego na celu wywołanie zjawiska LE jest bardzo prosta. Inkubacja pobranej „na skrzep” krwi żylnej i mechaniczne uszkodzenie komórek (przetarcie przez metalowe sito) ułatwiają ten proces. Z uzyskanego po odwirowaniu „kożuszka” leukocytów wykonuje się rozmazy, w których po wybarwieniu metodą Maya-Grünwalda-Giemsy w mikroskopie świetlnym określa się liczbę powstałych komórek LE na 500 „ocalałych” granulocytów [5].
Dodatni test na obecność komórek LE był przez ok. 30 lat pierwszym z „zaburzeń immunologicznych” należących do kryteriów klasyfikacyjnych SLE [7]. Pominięto je dopiero w zmodyfikowanych kryteriach wprowadzonych przez Amerykańskie Kolegium Reumatologiczne (ACR) w 1997 r. [8].

Dalsze badania związane ze zjawiskiem LE
Po ok. 10 latach od odkrycia komórek LE wykazano, że za zjawisko LE odpowiedzialne są przeciwciała przeciw natywnemu DNA (dsDNA), które odgrywają główną rolę w patogenezie SLE. Opracowano wówczas wiele nowych technik wykrywania przeciwciał, opartych na immunoprecypitacji, odczynie wiązania dopełniacza i hemaglutynacji. Później powstały kolejne metody, stosowane obecnie rutynowo – immunofluorescencja i ELISA – pozwalające nie tylko na stwierdzenie obecności przeciwciał, ale równocześnie na dokładne sprecyzowanie ich swoistości [9, 10]. Metody te – co jest oczywiste – zastąpiły żmudne liczenie komórek LE, które musiało przejść do historii. W piśmiennictwie ukazały się artykuły zatytułowane m.in. „Komórki LE na emeryturze” [11], a nawet „Śmierć komórek LE” [12]. Równocześnie jednak często podkreśla się, że odkrycie komórek LE było kamieniem milowym dla nowoczesnej immunologii klinicznej – rozpoczęło ono erę autoprzeciwciał! W niektórych laboratoriach w Polsce nadal wykonuje się „test LE”. Liczba komórek LE zwiększa się często wraz ze wzrostem aktywności SLE, co odgrywa rolę w monitorowaniu przebiegu choroby.
Pomimo „przechodzenia do historii” zjawisko LE jest nadal przedmiotem badań mających na celu wyjaśnienie procesów toczących się w komórkach w jego przebiegu. Zauważono niedawno, że przeciwciała przeciw dsDNA należące do immunoglobulin klasy G mogą przenikać do jąder żywych komórek, hamować w ich obrębie reakcje enzymatyczne i indukować apoptozę [13–15]. „Ciałka LE” powstawałyby więc w wyniku apoptozy. Powyższe spostrzeżenia mogą mieć znaczenie dla dalszych badań zmierzających do określenia roli przeciwciał przeciw antygenom wewnątrzkomórkowym w patofizjologii chorób autoimmunologicznych.

Komórki LE powstające in vivo
Rezygnując z oznaczania komórek LE jako testu diagnostycznego, zapomina się, że są one często tworzone in vivo w wysięku powstającym w jamie opłucnej lub osierdziowej u chorych na SLE [16]. Komórki te spostrzega się także w płynie stawowym w przebiegu tocznia rumieniowatego układowego (SLE) i reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) oraz zespołu nakładania tych chorób (SLE/RA) [17–22]. W jamie stawowej w tych przypadkach zachodzą dogodne warunki dla zjawiska LE: obecne są przeciwciała przeciw dsDNA, uszkodzona jest bariera naczyniowo-maziówkowa, w płynie stawowym występują liczne granulocyty obojętnochłonne znajdujące się w stanie „inkubacji”, które ulegają mechanicznym urazom związanym z tarciem uszkodzonych powierzchni stawowych [23, 24].
Ostatnio w komentarzu dotyczącym zaleceń Europejskiej Ligi do Walki z Chorobami Reumatycznymi, prof. Wallace zaznaczył, iż błędem jest pominięcie w zaleceniach znaczenia badania płynu mózgowo-rdzeniowego w diagnostyce tocznia neuropsychiatrycznego [25]. Autor ten stwierdza: „jest dobrze udokumentowane przez dane naukowe, że zwiększone stężenie białka, leukocytoza, synteza IgG, obecność prążków oligoklonalnych, przeciwciał antyneuronalnych lub komórek LE w płynie mózgowo-rdzeniowym wiąże się z zapaleniem naczyń w obrębie ośrodkowego układu nerwowego”.
Komórki LE łatwo jest wykryć w płynach wysiękowych. W barwionych rozmazach osadu można znaleźć „klasyczne” komórki, ciałka LE i tworzone przez nie rozety (ryc. 1 i 2). Powstawanie komórek LE in vivo może poprzedzać typowe objawy choroby i z tego powodu badanie to jest nadal wartościową metodą w diagnostyce laboratoryjnej układowych chorób tkanki łącznej.

Podsumowanie
1. Odkrycie komórek LE przed 60 laty było pierwszym tropem łączącym autoimmunizację z patogenezą układowych chorób tkanki łącznej.
2. Oznaczanie liczby komórek LE w „teście LE” zostało obecnie zastąpione czułymi i swoistymi metodami wykrywania przeciwciał przeciw dsDNA, nadal może być jednak przydatne do oceny aktywności choroby.
3. Mechanizm powstawania komórek odpowiedzialny za zjawisko LE jest w dalszym ciągu przedmiotem badań, a jego pełne poznanie będzie mieć znaczenie dla wyjaśnienia niektórych procesów związanych z patogenezą chorób autoimmunologicznych.
4. Wykrycie komórek LE powstających in vivo w płynach wysiękowych nadal stanowi wartościową i prostą metodę w diagnostyce SLE.

Komentarz
Nie ulega obecnie wątpliwości, że nowoczesne metody laboratoryjne pozwalają na znacznie szybsze, a przy tym bardziej precyzyjne wykrywanie przeciwciał przeciwjądrowych w porównaniu z liczeniem komórek LE. Budzi się jednak refleksja – w ostatnich latach eliminuje się coraz więcej takich „żmudnych” metod i zastępuje automatycznymi. Jest to oczywiście związane z postępem nauki i pozwala oszczędzać „bezcenny” czas, ale równocześnie automatyzacja niesie ze sobą różne zagrożenia. Oto jeden z przykładów: opracowano metodę oznaczania liczby i rodzaju leukocytów w płynie stawowym przy zastosowaniu automatycznego licznika używanego w hematologii [26]. Metoda ta nie może jednak zastąpić mikroskopowego badania komórek znajdujących się w płynie stawowym – nie są to bowiem wyłącznie leukocyty! Można w nim także znaleźć m.in. komórki LE, komórki Reitera, synowiocyty, lipofagi, komórki plazmatyczne, mieloblasty czy komórki nowotworowe. Każdy rodzaj tych komórek może odgrywać istotną rolę w diagnostyce.
Ponadto – komputer nie zauważy – tak jak uczynił to Malcolm M. Hargraves – nowych, nieznanych jeszcze zjawisk. Gdzie więc w przyszłości znajdzie się miejsce na „przypadkowe” odkrycia?

Piśmiennictwo
1. Hargraves MM, Richmond H, Morton RJ. Presentation of two bone marrow elements: the tart cell and the L. E. cell. Proc Mayo Clin 1948; 23: 25-28.
2. Hargraves MM. Discovery of the “L.E.” cell. Am Lupus Soc Quart 1984; 5: 1-2.
3. Nelson CW. Mayo and the LE cell. Mayo Clin Proc 1991; 66: 1190.
4. Sundberg RD, Lick NB. L.E. cells in the blood in acute disseminated lupus erythematosus. J Invest Derm 1949; 12: 83-84.
5. Lachmann P. A two-stage indirect L.E. cell test. Immunology 1961; 4: 142-152.
6. Holman HR, Kunkel HG. Affinity between the LE factor and cell nucleic acid nucleoprotein. Science 1957; 126: 162-163.
7. Tan EM, Cohen AS, Fries JF, et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25: 1271-1277.
8. Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1997; 40: 1725.
9. Pincus T. Classics in rheumatology. Clin Exp Rheumatol 1998; 16: 652.
10. Tan EM. The L.E. cell and its legacy. 1948. Clin Exp Rheumatol 1998; 16: 652-658.
11. Olive A. The retirement of LE cell. Medicina Clinica (Barc) 1999; 112: 799.
12. Piette JC. LE cell death. Presse Med 1997; 26: 6.
13. Ruiz-Argüelles A, Alarcon-Segovia D. Novel facts about an old marker: the LE cell. Scand J Clin Lab Invest 2001; suppl. 235: 31-37.
14. Böhm I. LE cell phenomenon: nuclear IgG deposits inhibit enzymatic cleavage of the nucleus of damaged cells and support its phagocytic clearance by PMN. Biomed Pharmacother 2004; 58: 196-201.
15. Böhm I. Flow cytometric analysis of the LE cell phenomenon. Autoimmunity 2004; 37: 37-44.
16. Zimmermann-Górska I, Konieczna B. Zjawisko LE w wysięku opłucnowym. Pol Arch Med Wewn 1981; 66: 243-245.
17. Zimmermann-Górska I. Zjawisko LE w płynie stawowym chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Reumatologia 1980; 19: 7-17.
18. Zimmermann-Górska I. LE phenomenon in synovial fluid. Rev Rheum 1981; No. special 1423.
19. Pollard KM, Furphy LJ, Webb J. Anti-Sm and anti-DNA antibodies in paired serum and synovial fluid samples from patients with SLE. Rheum Int 1988; 8: 197-204.
20. Vivino FB, Schumacher HR. Synovial fluid characteristics and the LE cell phenomenon in drug-induced lupus. Findings in three patients and a review of pertinent literature. Arthritis Rheum 1989; 32: 560-568.
21. Gatter RA, Schumacher HR. A practical handbook of joint fluid analysis. Second edition. Lea & Febiger, Philadelphia 1991.
22. Freemont AJ. Role of cytological analysis of synovial fluid in diagnosis and research. Ann Rheum Dis 1991; 50: 120-123.
23. Zimmermann-Górska I. Antinuclear antibodies in synovial fluid in rheumatoid arthritis and rheumatoid arthritis/systemic lupus erythematosus overlap syndrome. Period Biol 1987; 89 suppl. 1: 146.
24. Zimmermann-Górska I, Białkowska-Puszczewicz G, Puszczewicz M. Atlas płynu stawowego. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1995.
25. Wallace DJ. Aktualne zalecenia europejskie (EULAR 2008) dotyczące postępowania w toczniu rumieniowatym układowym – z perspektywy amerykańskiej. Med Prakt 2008/07.
26. Sugiuchi H, Ando Y, Manabe M, et al. Measurement of total and differential white blood cell counts in synovial fluid by means of an automated hematology analyzer. J Lab Clin Med 2005; 146: 36-42.