Jak3 expression and Stat3 activity in patients with rheumatoid arthritis and spondyloarthropathy

Wstęp

Wewnątrzkomórkowy układ przekaźnikowy Jak/ /Stat (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription) jest układem białek wykorzystywanych przez wiele cytokin, czynników wzrostu i hormonów do ekspresji genów, przez które dokonuje się proces aktywacji, proliferacji, różnicowania i apoptozy komórek. Receptory błonowe tych związków (receptory typu I/II) nie mają aktywności enzymatycznej, lecz współdziałają z rodziną białek cytoplazmatycznych mających właściwości kinaz. Połączenie liganda z receptorem błonowym aktywuje związaną z nim kinazę tyrozynową, która ulega autofosforylacji, a następnie fosforyluje zwrotnie cytoplazmatyczne domeny receptora. Do aktywnych domen receptora przyłączają się białka Stat, które po procesie dimeryzacji zostają odłączone od receptora i przemieszczone do jądra komórkowego, gdzie – wiążąc się z DNA odpowiedniego miejsca genu promotorowego – aktywują proces transkrypcji genów [1].
Kinaza tyrozynowa Jak3 należy do grupy enzymów wewnątrzkomórkowych, pozbawionych funkcji receptorowych, w skład której wchodzą Jak1, Jak2, Jak3, Tyk2. Białka te są aktywowane przez wiele cytokin i czynników wzrostu za pośrednictwem różnych receptorów. Kinaza Jak3 jest aktywowana za pośrednictwem receptora transbłonowego c tylko przez IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21 [2–4]. Cytokiny te łączą się także z innymi receptorami, natomiast pobudzają kinazę Jak3 tylko za pośrednictwem łańcucha . Efekt działania poszczególnych cytokin wiążących się z receptorem c przedstawiono w tabeli I. Gen kinazy Jak3 został zlokalizowany w miejscu p13.2 chromosomu 19 [1].
Jak3 ulega ekspresji konstytutywnej na wysokim poziomie w komórkach NK oraz w tymocytach, natomiast ekspresji indukcyjnej może ulegać w limfocytach B, limfocytach T i komórkach szpiku kostnego [5, 6]. Badania przeprowadzone u chorych na artropatie zapalne wykazały zwiększoną ekspresję kinazy Jak3 w synowiocytach, fibroblastach błony maziowej, komórkach CD45+, CD68+ oraz w komórkach dendrytycznych tych chorych w porównaniu z osobami zdrowymi [7–9].
U myszy utrata funkcji poszczególnych kinaz tyrozynowych skutkuje powstaniem ciężkich uszkodzeń organizmu i często jest letalna. Delecja genu kinazy tyrozynowej Jak3 nie jest natomiast letalna i skutkuje powstaniem ciężkiego wrodzonego zespołu niedoboru odporności (severe combined immunodeficiency – SCID), dziedziczonego autosomalnie dominująco. Powstaje fenotyp T–B+NK–. Myszy o fenotypie Jak3–/– wykazują głębokie niedobory komórek progenitorowych grasicy i mniejszą zdolność odtwarzania komórek T oraz istotnie zmniejszoną liczbę obwodowych limfocytów CD8+ i komórek NK [10, 11]. Podobny fenotyp SCID, ale dziedziczony w sposób sprzężony z chromosomem X, powstaje wtedy, gdy dochodzi do delecji genu receptora c. W obydwu przypadkach z powodu braku regulującej funkcji komórek T następuje upośledzenie aktywacji komórek B i zaburzenie produkcji przeciwciał, co przejawia się hipogammaglobulinemią i zaburzeniem wytwarzania przeciwciał w odpowiedzi na immunizację. Wynika z tego, że Jak3 odgrywa niezbędną rolę dla zależnego od receptora c rozwoju limfocytów B i T i zapobiegania c-zależnej apoptozy tymocytów [12, 13].
Kontrola limfopoezy przez Jak3 zachodzi przez wybiórczą modyfikację ekspresji proapoptycznego białka Bax i antyapoptotycznego białka Bcl-2. Tymocyty oraz obwodowe limfocyty T modeli zwierzęcych pozbawionych genu Jak3 wykazują dużą ekspresję Bax i zredukowane poziomy Bcl-2 w stosunku do osobników dzikich, co oznacza dużą podatność tych komórek na apoptozę. U tych osobników dochodzi do zaniku obwodowych limfocytów T i nieprawidłowego stosunku pomiędzy komórkami CD4+ i CD8+ [14].
Wyniki badań stały się podstawą do postawienia tezy, że zahamowanie aktywności kinazy Jak3 pozwoli na ograniczenie procesu zapalnego przez modyfikację funkcji komórek zapalnych. Zastosowanie specyficznego inhibitora Jak3 (CP-690,550) u szczurów, u których wywołano zapalenie stawów indukowane kolagenem (CIA) oraz adiuwantowe zapalenie stawów (AA), doprowadziło do zmniejszenia objawów klinicznych choroby oraz zmian strukturalnych tkanek objętych procesem zapalnym [15].
Dotychczasowe badania na modelach zwierzęcych doprowadziły do zainicjowania badań klinicznych z użyciem inhibitora Jak3 (CP-690550) u chorych na RZS i pacjentów po przeszczepie nerki, których wyniki są bardzo obiecujące [16, 17].
Obecnie znanych jest 7 naturalnie występujących białek rodziny Stat, tj. Stat1, Stat2, Stat3, Stat4, Stat5a, Stat5b, Stat6, spośród których najpowszechniejsze jest Stat3. Jest ono aktywowane przez cytokiny, czynniki wzrostu, onkogeny i interferony [18]. Wykazano jego istotną rolę w procesach embriogenezy [19], regulacji wzrostu i apoptozy [20], regeneracji nabłonków i w procesach gojenia się ran [19], w tym przede wszystkim w reorganizacji cytoszkieletu i migracji komórek [21], w modulacji procesów immunologicznych i inwolucji gruczołu piersiowego [20].
Stat3 jest uwalniane w sposób konstytutywny w komórkach nowotworowych, co wykazano w różnych typach nowotworów [22]. Jego udział w onkogenezie wyraża się zwiększoną ekspresją antyapoptotycznej rodziny białek Bcl, protoonkogenów myc i pim-1 oraz hamowaniem ekspresji białka Fas, co prowadzi do transformacji komórkowej [23].
Zaobserwowano, że mutacja receptora IL-6, powodująca nadreaktywność czynnika Stat3, warunkuje rozwój zapalenia stawów, a zablokowanie receptora dla IL-6 hamuje ten proces [24]. Wiodąca rola Stat3 w patogenezie zapalenia stawów polega na jego działaniu antyapoptotycznym i stymulującym wzrost synowiocytów. Mechanizm tego działania polega na podtrzymaniu ekspresji onkogenu myc i supresji apoptotycznego sygnału modulowanego przez naskórkowy czynnik wzrostu (epidermal growth factor – EGF) i inne czynniki [25]. W następstwie tego synowiocyty wykazują patologiczny fenotyp, charakteryzujący się wzmożoną proliferacją, opornością na apoptozę i inwazyjnością w stosunku do sąsiednich tkanek oraz ekspresją EGF i płytkopochodnego czynnika wzrostu (platelet-derived growth factor – PDGF).
Stat3 przypisywana jest zdolność stymulacji limfocytów T i produkcji przeciwciał, co jest jednym z kluczowych czynników w patogenezie autoimmunologicznego zapalenia stawów [20]. Powoduje też zahamowanie apoptozy oraz nasilenie proliferacji limfocytów T, a modyfikując funkcję komórek progenitorowych szpiku kostnego, hamuje granulopoezę [26]. Wykazano również, że pośrednictwo Stat3 w działaniu IL-6 jest niezbędne do zmniejszenia ekspresji transkrypcyjnego białka Foxp3 przez tę cytokinę [27]. To sugerowałoby, że poprzez hamowanie ekspresji białka Foxp3 i związaną z tym supresję limfocytów Treg Stat3 może wzmagać procesy immunologiczne i odgrywać rolę prozapalną.
Celem badania była analiza ekspresji kinazy tyrozynowej Jak3 i aktywacji Stat3 w komórkach płynu stawowego i leukocytach krwi obwodowej (LKO) u chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) i spondyloartropatie zapalne (SpaZ) oraz poszukiwanie korelacji badanych parametrów z aktywnością choroby, wskaźnikami procesu zapalnego oraz z zaawansowaniem choroby. Istotne było określenie, czy istnieją znaczące różnice w ekspresji Jak3 i aktywacji Stat3 pomiędzy grupą chorych na RZS a SpaZ.

Materiał i metody

Badaniem objęto grupę 41 chorych (25 kobiet i 16 męż­czyzn), wśród których znajdowali się chorzy na RZS (n = 19), spełniający kryteria ARA (American Rheumatism Association) z 1997 r. (15 kobiet, 79%), oraz chorzy na SpaZ (n = 22), spełniający kryteria ESSG (The European Spondyloarthropathy Study Group) z 1991 r. (10 kobiet, 45%). Średni wiek chorych wynosił 48,6 roku (19–81 lat). Grupa chorych na SpaZ wykazywała zróżnicowanie pod względem rozpoznania – na spondyloartropatię niezróżnicowaną (SpaN) chorowało 9 osób, na łuszczycowe zapalenie stawów (ŁZS) – 7 osób, a zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (ZZSK) rozpoznano u 6 osób.
Kryterium wykluczającym podczas kwalifikacji do badania było stosowanie ówcześnie lub uprzednio leków biologicznych, współistnienie ostrego lub przewlekłego procesu zapalnego innego niż zapalenie stawów i choroba nowotworowa stwierdzana obecnie lub w przeszłości. Grupę kontrolną stanowiły 23 zdrowe osoby, odpowiednio dobrane pod względem płci i wieku. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu.
W całej grupie chorych średni wiek wystąpienia pierwszych objawów choroby wynosił 41,2 (±16,38) roku, średni czas trwania choroby – 82,16 (±84,87) miesiąca (6,9 roku), a średni wiek chorych w chwili badania – 48,6 (±16,7) roku. W grupie chorych na RZS średnia wieku wynosiła 58,5 (±12,05) roku, średni wiek wystąpienia objawów – 50,5 (±14,69) roku, a średni czas trwania choroby – 7,6 (±6,34) roku. Średni wiek chorych na SpaZ wynosił 40 (±15,53) lat, średni wiek wystąpienia objawów to 33,2 (±13,45) roku, średni czas trwania choroby – 6,31 (±7,91) roku.
U wszystkich chorych stosowano standardową farmakoterapię. Aż 56% chorych przyjmowało niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), a 29% osób było leczonych glikokortykosteroidami (GKS). Spośród leków modyfikujących przebieg choroby (LMPCh) chorzy stosowali metotreksat (14 osób), sulfasalazynę (9 osób), cyklosporynę A (3 osoby), leflunomid (2 osoby) i azatioprynę (1 osoba). Rodzaj farmakoterapii stosowanej przez chorych przedstawiono w tabeli II.

Ocena kliniczna chorych

U chorych zakwalifikowanych do badania oceniano kliniczną i laboratoryjną aktywność choroby. Oceny klinicznej dokonano na podstawie wywiadu lekarskiego, badania fizykalnego, liczby bolesnych i obrzękniętych stawów, oceny aktywności choroby wg chorego na 100-mi­limetrowej wizualnej skali analogowej (VAS), ogólnej oceny sprawności fizycznej chorego (u 10 chorych na RZS i SpaZ bez zajęcia stawów kręgosłupa do oceny tej zastosowano standardowy Kwestionariusz oceny stanu zdrowia – HAQ, a u chorych na SpaZ z zajęciem stawów szkieletu osiowego – wskaźnik sprawności funkcjonalnej Bath – BASFI). W obu grupach chorych oznaczano szybkość opadania krwinek (OB), stężenie białka C-reaktywnego (CRP) oraz wykonano morfologię krwi obwodowej.
Grupę chorych na RZS i SpaZ scharakteryzowano pod względem aktywności choroby, którą oceniono na podstawie wskaźników DAS28 i BASDAI. Grupę chorych na RZS podzielono na trzy podgrupy wg aktywności choroby, którą ustalono na podstawie wskaźnika DAS28: grupa A z małą aktywnością choroby (DAS28  3,2) – 4 osoby (21%), grupa B ze średnią aktywnością choroby (3,2 < DAS28  5,1) – 7 osób (37%), grupa C z dużą aktywnością choroby (DAS28 > 5,1) – 8 osób (42%). Grupę chorych na SpaZ podzielono na trzy podgrupy wg aktywności choroby, którą ustalono na podstawie wskaźników DAS28 i BASDAI. W grupie chorych na SpaZ wskaźnik DAS28 oznaczono u pacjentów z zajęciem tylko stawów obwodowych, a wskaźnik BASDAI – u chorych z zajęciem stawów szkieletu osiowego. I tak: grupa D z małą aktywnością choroby (BASDAI  3, DAS28 jw.) – 5 osób (23%), grupa E ze średnią aktywnością choroby (3 < BASDAI  4, DAS28 jw.) – 8 osób (36%), grupa F z dużą aktywnością choroby (BASDAI > 4, DAS28 jw.). Podstawową charakterystykę badanych grup pod względem aktywności choroby i sprawności chorych na podstawie odpowiednich wskaźników przedstawiono w tabeli III.
W celu oceny zaawansowania choroby wykonano rentgenogramy zajętych procesem chorobowym stawów w projekcji przednio-tylnej. Zaawansowanie zmian w stawach obwodowych było oceniane wg skali Steinbrockera, a zaawansowanie zmian w stawach krzyżowo-biodrowych na podstawie czterostopniowej, powszechnie używanej skali. W przypadku chorych na SpaZ, u których stwierdzono zajęcie stawów obwodowych i szkieletu osiowego, stopień zaawansowania choroby oceniano osobno w tych obszarach i choremu ostatecznie przypisywano wyższy stopień zaawansowania choroby, wynikający z tych dwóch klasyfikacji. Najliczniejszą grupę stanowili chorzy, u których stwierdzono mały (pierwszy i drugi) stopień zaawansowania choroby (ryc. 1).

Metody badania ekspresji kinazy Jak3 i aktywacji czynnika transkrypcyjnego Stat3

U wszystkich chorych i u osób z grupy kontrolnej wykonano oznaczenia ekspresji kinazy Jak3 i czynnika transkrypcyjnego Stat3 w LKO. Ponadto u 24 chorych (11 chorych na RZS) oznaczono te parametry także w KPS.
Do oznaczenia ekspresji kinazy Jak3 i aktywacji białka Stat3 wykorzystano metody immunocytochemiczne. Ekspresję kinazy Jak3 oznaczono przy użyciu gotowych zestawów firmy Santa Cruz Biotechnology (USA), a aktywację czynnika Stat3 oznaczano za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych firmy Chemicon International Inc. (USA) i zestawu Dak^oCytomation EnVision + System-HRP (DAB) firmy Dako Denmark A/S (Dania). Stosowano standardowe procedury dla każdej metody.
Ekspresję kinazy tyrozynowej Jak3 wyrażano przez odsetek komórek z zabarwioną cytoplazmą utrwalonych na szkiełkach (średnia z trzech preparatów).
Zakładając, że obecność białka Stat w obrębie jądra komórkowego jest tożsama z obecnością aktywnej formy tego białka, oceniano odsetek komórek z zabarwionym jądrem (średnia z trzech preparatów).
Badania ekspresji Jak3 oraz aktywacji Stat3 przeprowadzono w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu.

Metody statystyczne

Do analizy uzyskanych danych użyto standardowych metod statystycznych. Dla wszystkich zmiennych mierzalnych wyznaczono charakterystyki opisowe: średnią arytmetyczną, medianę, wartość minimalną i maksymalną, odchylenie standardowe i wariancję. Jako poziom istotności we wszystkich testach przyjęto p = 0,05.
Do testowania zgodności cech mierzalnych z rozkładem normalnym zastosowano test Shapiro-Wilka. Do porównywania dwóch grup użyto testu t-Studenta, w przypadku cech pochodzących z rozkładu normalnego i o jednorodnych wariancjach. Jednorodność wariancji sprawdzana była testem Bartletta. W przypadku gdy przynajmniej jeden z tych warunków nie został spełniony (cecha miała rozkład różny od normalnego lub wariancje w porównywanych grupach były niejednorodne), porównania rozkładów cechy w tych dwóch populacjach dokonano nieparametrycznym testem U Man­na-Whitneya. Test Kruskala-Wallisa stosowano do po­rów­nywania cechy w więcej niż dwóch populacjach. Przy badaniu związku między cechami mierzalnymi wykorzystano współczynniki korelacji. Dla par cech o rozkładach normalnych obliczono współczynniki korelacji Pearsona; dla par cech o rozkładach różnych od normalnego obliczono współczynniki korelacji rang Spearmana. Gdy korelacja Pearsona była istotna statystycznie (p < 0,05), wyznaczano funkcję liniową regresji. Do analizy statystycznej zastosowano program Statistica.

Wyniki

Parametry laboratoryjne

U wszystkich chorych wykonano oznaczenia podstawowych wskaźników stanu zapalnego – morfologii krwi obwodowej, OB i CRP. U 23 chorych wykonano punkcję stawu i oznaczono liczbę komórek płynu stawowego. Wyniki tych badań przedstawiono w tabeli IV. Badane grupy różniły się istotnie statystycznie pod względem wieku chorych (58,5 roku vs 40 lat), wieku wystąpienia objawów choroby (50,5 vs 32,2 roku), stopnia zaawansowania choroby (2,6 vs 1,8), liczby obrzękniętych stawów (5,6 vs 2,7) i MCV (91,0 vs 87,2 fl) (p < 0,05). Ekspresja Jak3 i aktywacja Stat3 Stwierdzono istotnie bardziej nasiloną ekspresję kinazy Jak3 i aktywację czynnika Stat3 w LKO w całej grupie badanej, w grupie chorych na RZS i grupie chorych na SpaZ w porównaniu z grupą kontrolną (test t-Studenta; p < 0,05) (tab. V). Różnice w wartościach badanych parametrów pomiędzy grupą chorych na RZS i SpaZ nie były istotne statystycznie (test t-Studenta; Jak3: p = 0,93; Stat3: p = 0,46).
Obserwowano istotnie większą ekspresję kinazy Jak3 w KPS w porównaniu z ekspresją w LKO, co wykazano w całej grupie badanej, u mężczyzn w tej grupie oraz u chorych na SpaZ. W przypadku Stat3 wykazano istotnie wyższą aktywację tego białka w KPS niż w LKO w całej grupie badanej i we wszystkich badanych podgrupach (tab. VI).
W żadnej z badanych grup nie obserwowano korelacji między stopniem ekspresji Jak3 a aktywacji Stat3.
W całej grupie badanej wykazano ujemne korelacje między ekspresją kinazy Jak3 w KPS a wartością HAQ i liczbą bolesnych stawów (współczynnik Spearmana – s; odpowiednio –0,44 i –0,43). W grupie wszystkich badanych kobiet wykazano ujemną korelację między ekspresją Jak3 w KPS a wartością HAQ (s = –0,62). W grupie mężczyzn stwierdzono ujemną korelację między ekspresją Jak3 w LKO (współczynnik Pearsona – r; r = –0,56) a wartością HAQ oraz dodatnią korelację między aktywacją Stat3 w KPS a wartością HAQ (s = 0,72).
W grupie chorych na RZS wykazane zależności między badanymi cechami dotyczyły tylko białka Stat3. Wykazano dodatnią korelację między aktywnością Stat3 w LKO a wiekiem chorych (r = 0,63) i wiekiem wystąpienia objawów (r = 0,55), ujemną korelację między aktywacją tego białka w LKO a liczbą obrzękniętych stawów (s = –0,60) oraz ujemną korelację między aktywacją Stat3 w KPS a czasem trwania choroby (r = –0,69) i dodatnią korelację między aktywacją Stat3 w KPS a stężeniem CRP (r = 0,62).
W grupie chorych na SpaZ wykazano ujemną korelację między wartością VAS a ekspresją kinazy Jak3 w KPS (r = –0,72).

Omówienie

Dotychczasowe doniesienia dotyczące aktywacji układu Jak/Stat w zapalnych chorobach stawów ograniczają się do badań komórek błony maziowej. Niewiele publikacji dotyczy funkcjonowania tego układu przekaźnikowego w komórkach krwi obwodowej i płynu stawowego, a niejednokrotnie brak w tych badaniach odniesienia do klinicznych wykładników aktywności choroby. Ocena taka wydaje się możliwa w sposób pośredni przy uwzględnieniu faktu, iż RZS i SpaZ są schorzeniami o charakterze układowym, w których zmiany stawowe są jednym z przejawów choroby.
Wiele opracowań na temat roli kinazy tyrozynowej Jak3 dotyczy chorych na RZS i w tej grupie chorych prowa­dzone są badania nad możliwością praktycznego wykorzystania inhibitorów układu Jak/Stat. Obecnie u cho­rych na RZS przeprowadzane są badania kliniczne substancji wybiórczo blokujących aktywność kinazy Jak3 oraz powstają kolejne selektywne inhibitory tego białka [17].
Nieliczne doniesienia dotyczą natomiast funkcji układu Jak/Stat w patogenezie spondyloartropatii zapalnych. Walker i wsp. oceniali zróżnicowanie ekspresji układu Jak/Stat u chorych na RZS, SpaZ i chorobę zwyrodnieniową stawów (ChZS) [7]. Do grupy chorych na SpaZ zakwalifikowano pięciu pacjentów chorych na SpaN, czterech chorych na ŁZS i jednego chorego z ZZSK. Chorzy byli leczeni LMPCh, NLPZ oraz GKS i allopurinolem. Grupę kontrolną stanowiły osoby zdrowe. Badanie ekspresji kinazy tyrozynowej Jak3 (oraz Stat1, Stat4, Stat6) przeprowadzono na komórkach błony maziowej pobranych drogą mikrobiopsji i oceniono metodą immunohistochemiczną. Stwierdzono istotnie większą ekspresję Jak3 w komórkach błony maziowej chorych na RZS i SpaZ w porównaniu z osobami zdrowymi. Także ekspresja Jak3 w tych komórkach była większa u chorych na ChZS niż w grupie kontrolnej, lecz mniejsza niż u chorych na RZS i SpaZ. Nie wykazano istotnej różnicy pomiędzy ekspresją Jak3 u chorych na RZS i SpaZ. Nie obserwowano też związku pomiędzy ekspresją kinazy Jak3 a wiekiem chorych, czasem trwania choroby, stężeniem CRP i stosowanym leczeniem. Ekspresja Jak3 była również duża w komórkach CD45+ i CD68+ [7]. W badaniu dotyczącym ekspresji Jak3 w komórkach dendrytycznych błony maziowej chorych na RZS także nie obserwowano związku pomiędzy ekspresją kinazy Jak3 a wiekiem chorych, czasem trwania choroby, stężeniem CRP i stosowanym leczeniem [9].
W innym badaniu Walker i wsp. metodą immunohistochemiczną oceniali wpływ terapii LMPCh na aktywację układu Jak/Stat w komórkach błony maziowej u chorych na RZS. Do badania zakwalifikowano 16 pacjentów, u których na podstawie wskaźnika DAS28 stwierdzono dużą aktywność choroby. U tych chorych oceniono ekspresję Jak3 przed rozpoczęciem terapii LMPCh i po 6-mie­sięcznym leczeniu. Jedenaście osób spełniało kryteria odpowiedzi na zastosowane leczenie (wg DAS28 i wg ACR). Ekspresję kinazy obserwowano w komórkach dendrytycznych CD1+, makrofagach CD68+ i limfocytach T. W wyniku skutecznej terapii LMPCh u chorych nie doszło do znacznego zmniejszenia ekspresji kinazy Jak3 w komórkach błony maziowej, a do zaniku komórek dendrytycznych wykazujących ekspresję kinazy Jak3, co wskazywałoby na znaczący udział tych komórek w patogenezie RZS. U pięciu pacjentów, u których nie uzyskano dobrego wyniku terapeutycznego, nie obserwowano także znaczących zmian ekspresji Jak3 w komórkach błony maziowej i w komórkach dendrytycznych [8].
Wyniki niniejszej pracy przedstawiały się w sposób analogiczny, choć metody badań ekspresji Jak3 nieco się różniły. Podstawową różnicę stanowił materiał badawczy – Walker i wsp. wykorzystywali do badania komórki błony maziowej. Autorzy przedstawionego badania założyli, że jeżeli białka układu Jak/Stat będą aktywne w komórkach infiltrujących błonę maziową, to będą one także aktywne w komórkach płynu stawowego i krwi obwodowej. Założenie to oparto na powszechnie znanym zjawisku migracji leukocytów z krwi obwodowej do tkanek i odwrotnie oraz na ogólnoustrojowym charakterze choroby. W obydwu badaniach do oznaczenia ekspresji kinazy Jak3 oraz aktywności białek Stat zastosowano metodę immunohistochemiczną. W przedstawianym badaniu nie oznaczano typu komórek, w których obserwowano podwyższoną ekspresję kinazy Jak3.
W omawianym badaniu wykazano istotnie większą ekspresję kinazy Jak3 w LKO zarówno u chorych na RZS, jak i na SpaZ, w porównaniu z grupą kontrolną. Nie wykazano istotnych różnic wartości badanego parametru pomiędzy grupą chorych na RZS i SpaZ. Wydaje się więc, że pomimo różnic w manifestacji klinicznej tych chorób, w ich patogenezę w podobnym stopniu zaangażowane są te same szlaki transmisyjne, co stwarza szansę na zastosowanie inhibitorów Jak3 w leczeniu zarówno w RZS, jak i SpaZ.
W obu grupach chorych nie wykazano związku pomiędzy ekspresją Jak3 a czasem trwania choroby, wiekiem chorego, wartościami parametrów stanu zapalnego (m.in. CRP), wskaźnikami DAS28 i BASDAI. Nie wykazano także związku pomiędzy stopniem zaawansowania choroby a ekspresją Jak3 w KPS i LKO. Te wyniki, pomimo różnicy w użytym do badań materiale biologicznym, są zgodne z przedstawianymi w literaturze [7–9].
Nie wykazano korelacji pomiędzy ekspresją Jak3 a aktywacją Stat3 zarówno w KPS, jak i w LKO. Może to być związane z szerokim profilem cytokin aktywujących białka Stat, które w swoim szlaku transmisji sygnału wykorzystują także inne kinazy niż Jak3 [1]. Wykazano natomiast ujemną korelację pomiędzy ekspresją Jak3 w płynie stawowym a wartością HAQ i liczbą bolesnych stawów, dotyczącą całej grupy oraz grupy kobiet.
Wykazano też ujemną korelację między ekspresją Jak3 w LKO a wartością HAQ u mężczyzn (w całej grupie badanej) oraz ujemną korelację pomiędzy ekspresją Jak3 w KPS u mężczyzn chorych na SpaZ a wskaźnikiem VAS. Być może na takie wyniki miały wpływ leki inne niż LMPCh stosowane przez chorych zakwalifikowanych do badania (np. GKS i NLPZ), których zwiększone dawki chorzy przyjmują w czasie wzrostu aktywności choroby i które mają działanie przeciwbólowe, zwiększając tym samym sprawność chorych i jednocześnie nie wpływając na ekspresję kinazy Jak3. Większość chorych zakwalifikowanych do badania stosowała LMPCh, NLPZ i GKS, natomiast w badaniu Walker i wsp. [8] chorzy stosowali tylko LMPCh, które nie wywierają bezpośredniego działania przeciwbólowego.
Wyniki prezentowanego badania wykazały różnice w stopniu ekspresji Jak3 pomiędzy KPS a LKO w poszczególnych grupach chorych. Obserwowano zwiększoną ekspresję Jak3 w KPS w porównaniu z ekspresją tego enzymu w LKO. Obserwacja ta dotyczyła całej grupy badanej, mężczyzn w tej grupie oraz chorych na SpaZ. Zwiększona ekspresja Jak3 w KPS może wynikać z większej intensywności procesu zapalnego w obrębie struktur stawu w porównaniu z toczącymi się w pozostałych układach organizmu. Pozostaje jednak pytanie, dlaczego taka obserwacja nie dotyczy chorych kobiet oraz chorych na RZS. Badane podgrupy chorych (RZS i SpaZ) różniły się istotnie statystycznie m.in. pod względem wieku chorych, wieku wystąpienia pierwszych objawów choroby i stopnia zaawansowania choroby (średnie tych wartości były statystycznie większe w grupie chorych na RZS). Być może czynniki te miały pewien wpływ na obserwowane wyniki. Na prezentowane różnice w ekspresji Jak3 u chorych w przeprowadzonym badaniu mogła mieć wpływ płeć chorych, ponieważ nie obserwowano różnicy w ekspresji Jak3 pomiędzy LKO a KPS w grupie chorych kobiet i chorych na RZS, w której była znacząca przewaga kobiet (15 kobiet, 4 mężczyzn). Ponadto grupa chorych na RZS różniła się pod względem stosowanego leczenia od grupy chorych na SpaZ – ­ 14 chorych na RZS stosowało LMPCh, a 5 osób z tej grupy zażywało tylko NLPZ. W grupie chorych na SpaZ ponad 12 osób stosowało tylko NLPZ, a pozostałych 10 chorych zażywało LMPCh. Fakt ten mógł wpłynąć na obserwowaną różnicę w ekspresji Jak3 pomiędzy LKO a KPS. W dotychczas opublikowanym piśmiennictwie nie przedstawiono badań, które porównywałyby ekspresję Jak3 pomiędzy KPS a LKO, w związku z czym istnieje duża, obiektywna trudność w ustosunkowaniu się do otrzymanych wyników.
Pierwszymi badaczami, którzy wykazali rolę prozapalną Stat3 w patogenezie autoimmunologicznego zapalenia stawów, byli Wang i wsp. Poddawali oni działaniu zapalnego płynu stawowego komórki jednojądrowe krwi obwodowej osób chorych na RZS i SpaZ. Celem badania było stworzenie warunków podobnych do tych, w jakich znajdują się komórki jednojądrowe napływające z krwi obwodowej do zmienionego zapalnie stawu. Autorzy zaobserwowali hamowanie aktywacji Stat1, ale nie Stat3, w monocytach pod wpływem płynu stawowego, a ponadto wykazali obecność aktywnego Stat3 w komórkach izolowanych z płynu stawowego [28].
Rola Stat3 w RZS była badana również przez zespół Shouda, który oceniał aktywność Stat3 i SOCS3/CIS3 (naturalnych inhibitorów Stat3) w błonie maziowej chorych na RZS i ChZS, wykorzystując do tych badań również mysie modele zapalenia stawów – AIA i CIA. Aktywację Stat3 oceniano metodą immunohistochemiczną. Wykazano zwiększoną aktywację Stat3 i SOCS3 (wyrażoną poprzez CIS3 mRNA) w komórkach chorych na RZS w porównaniu z chorymi na ChZS. Po wykonaniu okołostawowej iniekcji adenowirusa wykazującego dużą ekspresję CIS3 zwierzętom chorym na AIA i CIA uzyskano znaczne zmniejszenie obrzęków stawów, ich deformacji i ankylozy, co potwierdzałoby bezpośrednie, prozapalne działanie Stat3 u chorych na RZS, do czego przychylają się inni badacze [29].
Krause i wsp. analizowali rolę Stat3 w funkcjonowaniu synowiocytów u chorych na RZS. Do badanych kultur synowiocytów transferowano sekwencję mutanta genu kodującego Stat3 o fenotypie Stat3–/–, nazywanego Stat3-YF, który wykazywał nadekspresję Stat3–/–, blokując przy tym ekspresję prawidłowego, komórkowego genu Stat3 oraz zależnych od niego protoonkogenów socs3 i myc. W wyniku tego obserwowano zahamowanie wzrostu i spontaniczną apoptozę ponad 90% synowiocytów. Doszło też do zmiany odpowiedzi komórkowej na EGF – zamiast stymulowania wzrostu komórek, obserwowano ich śmierć, w wyniku przejęcia dominującej roli przez proapoptotyczny sygnał Stat1 w komórkach z zahamowaną czynnością Stat3. Potwierdzeniem tego było zaobserwowane zmniejszenie śmiertelności synowiocytów indukowanych przez EGF w liniach komórkowych, w których wprowadzono zarówno mutanty Stat3-YF, jak i Stat1-YF [25].
W prezentowanym badaniu aktywację Stat3 oceniono metodą immunocytochemiczną, podobnie jak w badaniu Shouda i wsp. [24]. Wykazano wyższy stopień aktywacji Stat3 w LKO w grupie badanej w porównaniu z grupą kontrolną. Zaobserwowano też wyższą aktywację Stat3 w KPS w porównaniu z jego aktywacją w LKO. Obserwacje te dotyczyły zarówno całej grupy badanej, jak i osobno chorych na RZS i SpaZ. Takie wyniki wskazują na znaczącą rolę Stat3 w patogenezie nie tylko RZS, ale także SpaZ. W badaniu tym nie wykazano zależności pomiędzy stopniem aktywacji Stat3 w KPS i LKO a aktywnością choroby mierzoną przy użyciu DAS28 i BASDAI. Obserwowano natomiast dodatnią korelację u wszystkich mężczyzn w grupie badanej między aktywacją Stat3 i HAQ. Fakt, że nie odnotowano takiej zależności u mężczyzn w poszczególnych grupach chorych, wynika być może z małej liczby mężczyzn (w porównaniu z całą grupą), szczególnie w grupie chorych na RZS. Brak takiej zależności u kobiet może natomiast wynikać z wpływu hormonów płciowych na aktywność Stat3 i z pewnością wymaga dalszej obserwacji.
Obserwowano także ujemną korelację między aktywacją Stat3 w komórkach płynu stawowego a czasem trwania choroby u osób z RZS. Być może wyjaśnienie tego zjawiska leży w zróżnicowaniu cytokinowym początkowej i przewlekłej fazy choroby, jakie zachodzi w przebiegu artropatii zapalnych, co może znajdować odzwierciedlenie w aktywności niektórych białek Stat. Tezę tę potwierdziły badania Ulfgren i wsp., które wykazały, że u chorych na wczesne RZS synteza TNF-, IL-1 i IL-1b w komórkach błony maziowej była znacznie większa niż u chorych z późną postacią RZS [30]. Ponadto początkowy okres choroby charakteryzuje się najczęściej jej dużą aktywnością, która zostaje przynajmniej częściowo stłumiona przez zastosowanie LMPCh oraz leków przeciwzapalnych, czemu może towarzyszyć zmniejszenie aktywacji Stat3.
W żadnej z badanych grup chorych nie obserwowano zależności między aktywacją Stat3 a stopniem zaawansowania choroby. Wykazano natomiast dodatnią korelację między aktywacją Stat3 w KPS a stężeniem CRP u chorych na RZS. Może to mieć związek ze zwiększonym stężeniem IL-6, aktywującej Stat3, i w mniejszym stopniu Stat1, które jest obserwowane w przebiegu RZS. Interleukina 6 za pośrednictwem Stat aktywuje geny kodujące białka ostrej fazy, białka związane z metabolizmem kostnym, regulatory apoptozy (bclx), czynniki transkrypcyjne i wiele innych [1]. Wyniki te potwierdzałyby więc znaczący prozapalny charakter białka Stat3, szczególnie w RZS. Stwierdzono jednak występowanie ujemnej korelacji między stopniem aktywacji tego białka w LKO chorych na RZS a liczbą obrzękniętych stawów (s = –0,60), co zaprzeczałoby prozapalnej funkcji Stat3 i co z pewnością wymaga przeprowadzenia dalszych badań nad funkcją Stat3 w patogenezie tej choroby.

Wnioski

Na podstawie analizy otrzymanych wyników można sformułować następujące wnioski:
1. Kinaza tyrozynowa Jak3 oraz czynnik transkrypcyjny Stat3 są związane z toczącym się procesem immunologicznym w przebiegu RZS i SpaZ – ich ekspresja i aktywacja jest wyższa u chorych w porównaniu z osobami zdrowymi.
2. Czynnik Stat3 prawdopodobnie wykazuje działanie prozapalne – jego aktywacja jest dodatnio skorelowana ze stężeniem białka CRP, chociaż wykazuje ujemną korelację z liczbą obrzękniętych stawów.
3. Nie ma bezpośredniego związku pomiędzy ekspresją kinazy Jak3 a aktywacją czynnika Stat3, co prawdopodobnie jest związane z wpływem innych czynników modulujących aktywność tych białek.
4. Z uwagi na brak różnic w ekspresji kinazy Jak3 w LKO pomiędzy chorymi na RZS i SpaZ i na wyższy stopień ekspresji Jak3 w KPS niż w LKO u chorych na SpaZ oraz biorąc pod uwagę wyniki badań klinicznych z inhibitorem Jak3 u chorych na RZS, istnieją przesłanki co do podobnej skuteczności tej substancji również u chorych na SpaZ.

Piśmiennictwo

 1. Rich RR. Clinical immunology: Principles and practice, 3rd Edition. Mosby Elsevier 2008.  
2. Noguchi M, Yi H, Rosenblatt HM, et al. Interleukin-2 receptor gamma chain mutation results in X-linked severe combined immunodeficiency in humans. Cell 1993; 73: 147-157.  
3. Asao H, Okuyama C, Kumaki S, et al. Cutting edge: the common gamma-chain is an indispensable subunit of the IL-21 receptor complex. J Immunol 2001; 167: 1-5.  
4. Pellegrini S, Dusanter-Fourt I. The structure, regulation and function of the Janus kinases (JAKs) and the signal transducers and activators of transcription (STATs). Eur J Biochem 1997; 248: 615-633.  
5. Gurniak CB, Berg LJ. Murine JAK3 is preferentially expressed in hematopoietic tissues and lymphocyte precursor cells. Blood 1996; 87: 3151-3160.
 6. Tortolani PJ, Lal BK, Riva A, et al. Regulation of JAK3 expression and activation in human B cells and B cell malignancies. J Immunol 1995; 155: 5220-5226.
 7. Walker JG, Ahern MJ, Coleman M, et al. Expression of Jak3, STAT1, STAT4 and STAT6 in inflammatory arthritis: unique Jak3 and STAT4 expression in dendritic cells in seropositive rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2006; 65: 149-156.
 8. Walker JG, Ahern MJ, Coleman M, et al. Changes in synovial tissue Jak-STAT expression in rheumatoid arthritis in response to successful DMARD treatment. Ann Rheum Dis 2006; 65: 1558-1564.
9. Walker JG, Ahern MJ, Coleman M, et al. Characterisation of a dendritic cell subset in synovial tissue which strongly expresses Jak/STAT transcription factors from patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2007; 66: 992-999.
10. Macchi P, Villa A, Giliani S, et al. Mutations of Jak-3 gene in patients with autosomal severe combined immune deficiency (SCID). Nature 1995; 377: 65-68.
11. Russell SM, Tayebi N, Nakajima H, et al. Mutation of Jak3 in a patient with SCID: essential role of Jak3 in lymphoid development. Science 1995; 270: 797-800.
12. Cao X, Shores EW, Hu-Li J, et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity 1995; 2: 223-238.
13. Suzuki K, Nakajima H, Saito Y, et al. Janus kinase 3 (Jak3) is essential for common cytokine receptor gamma chain (gamma(c))-dependent signaling: comparative analysis of gamma(c), Jak3, and gamma(c) and Jak3 double-deficient mice. Int Immunol 2000; 12: 123-132.
14. Wen R, Wang D, McKay C, et al. Jak3 selectively regulates bax and Bcl-2 expression to promote T-cell development. Mol Cell Biol 2001; 21: 678-689.
15. Milici A, Kudlacz E, Audoly L, et al. Cartilage preservation by inhibition of Janus kinase 3 in two rodent models of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2008; 10: R14.
16. Kanik K, Fleischmann R, Cutolo M, et al. Phase 2b dose ranging monotherapy study of the oral jak inhibitor CP-690,550 (CP) or adalimumab (ADA) vs placebo (PBO) in patients (PTS) with active rheumatoid arthritis (RA) with an inadequate response to DMARDS. Ann Rheum Dis 2009; 68 (Suppl 3): abstract 123.
17. Pesu M, Laurence A, Kishore N, et al. Therapeutic targeting of Janus kinases. Immunol Rev 2008; 223: 132-142.
18. Levy DE, Lee CK. What does Stat3 do? J Clin Invest 2002; 109: 1143-1148.
19. Akira S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells 1999; 17: 138-146.
20. Akira S. Roles of STAT3 defined by tissue-specific gene targeting. Oncogene 2000; 19: 2607-2611.
21. Debidda M, Wang L, Zang H, et al. A role of STAT3 in Rho GTPase-regulated cell migration and proliferation. J Biol Chem 2005; 280: 17275-17285.
22. Bromberg J. Stat proteins and oncogenesis. J Clin Invest 2002; 109: 1139-1142.
23. Ivanov VN, Bhoumik A, Krasilnikov M, et al. Cooperation between STAT3 and c-jun suppresses Fas transcription. Mol Cell 2001; 7: 517-528.
24. Shouda T, Yoshida T, Hanada T, et al. Induction of the cytokine signal regulator SOCS3/CIS3 as a therapeutic strategy for treating inflammatory arthritis. J Clin Invest 2001; 108: 1781-1788.
25. Krause A, Scaletta N, Ji JD, Ivashkiv LB. Rheumatoid arthritis synoviocyte survival is dependent on Stat3. J Immunol 2002; 169: 6610-6616.
26. Lee CK, Raz R, Gimeno R, et al. STAT3 is a negative regulator of granulopoiesis but is not required for G-CSF-dependent differentiation. Immunity 2002; 17: 63-72.
27. Yao Z, Kanno Y, Kereny M, et al. Nonredundant roles for STAT5a/b in directly regulating Foxp3. Blood 2007; 109: 4368-4375.
28. Wang F, Sengupta TK, Zhong Z, Ivashkiv LB. Regulation of the balance of cytokine production and the signal transducer and activator of transcription (STAT) transcription factor activity by cytokines and inflammatory synovial fluids. J Exp Med 1995; 182: 1825-1831.
29. Ernst M, Inglese M, Waring P, et al. Defective gp130-mediated signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling results in degenerative joint disease, gastrointestinal ulceration, and failure of uterine implantation. J Exp Med 2001; 194: 189-203.
30. Ulfgren AK, Gröndal L, Lindblad S, et al. Interindividual and intra-articular variation of proinflammatory cytokines in patients with rheumatoid arthritis: potential implications for treatment. Ann Rheum Dis 2000; 59: 439-447.