ORIGINAL PAPER
Appreciation of value of bacteriological serodiagnostic in patients with undifferentiated arthritis

Analiza badań na obecność przeciwciał dla Yersinia enterocolitica O3 w surowicach pacjentów diagnozowanych w Instytucie Reumatologii w latach 2004–2006; ich przydatność serodiagnostyczna w aspekcie reakcji krzyżowych z innymi drobnoustrojami istotnymi w wywoływaniu procesów zapalnych w chorobach narządu ruchu
Diagnostyka chorób narządu ruchu o etiologii bakteryjnej wymaga udowodnienia trwającej lub niedawno przebytej infekcji przy użyciu metod mikrobiologicznych, genetycznych bądź serologicznych.
Mimo dynamicznego rozwoju metod umożliwiających wykrycie żywych bakterii lub ich antygenów, w tym kwasów nukleinowych [1–6], metody serologiczne [4, 7, 8] nadal są powszechnie stosowane [7, 9]. Stanowią one jednak pośredni dowód niedawno przebytej lub aktualnie trwającej infekcji; często może być tak, że z chwilą zniknięcia objawów zakażenia, a także negatywnych wyników posiewów, przeciwciała, zwłaszcza klasy IgG, mogą utrzymywać się latami w surowicach, utrudniając precyzyjne określenie czasu uprzednio zaistniałej infekcji.
Pomijając zalety wykrywania poszczególnych etapów zakażenia przez stwierdzenie przeciwciał odpowiednich klas immunoglobulin osobno i/lub razem, należy nadmienić, iż przeciwciała klasy IgM często są niewykrywalne, np. u pacjentów z reaktywnym zapaleniem stawów (ReZS), którego objawy pojawiają się z opóźnieniem (zwykle trwającym kilka tygodni), w momencie zaistniałej serokonwersji klasy IgM do IgG.
Istotną wadą metod serologicznych jest także bardzo częste zjawisko krzyżowych reakcji i to czasami między drobnoustrojami odległymi taksonomicznie, np. między Chlamydia trachomatis a Salmonella enteritidis [9–14]. Jednak ze względu na to, że objawy stawowe są również często opóźnione w stosunku do możliwości wyhodowania drobnoustroju, metody serologiczne nadal są traktowane jako podstawowe (po wyeliminowaniu wymienionych wątpliwości) w diagnozowaniu np. spondyloartropatii o ewentualnym podłożu infekcyjnym.
W Zakładzie Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii od ponad 20 lat stosuje się diagnostykę serologiczną, sukcesywnie ją rozszerzając, począwszy od pierwszego drobnoustroju, którym była pałeczka Gram-ujemna z rodziny Enterobacteriaceae – Yersinia enterocolitica. Bakteria ta, zwłaszcza serotyp O3 najczęściej (oprócz O9 i O5) występujący w krajowej populacji (jeden z ok. 60 serotypów), jest opisywana w piśmiennictwie światowym jako patogen bytujący w przewodzie pokarmowym, przenoszony przez zakontaminowaną wodę lub żywność. Typowymi objawami ostrej infekcji Yersinia są: biegunka, ból brzucha i gorączka. Powikłaniami zakażenia tym drobnoustrojem są najczęściej: reaktywne zapalenie stawów, rumień guzowaty i inne choroby reumatyczne, często u osób z obecnością antygenu HLA-B27.
Spośród wielu drobnoustrojów, cytowanych w piś-miennictwie [7, 15, 16], potencjalnie związanych z etiologią niektórych chorób reumatycznych, w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii w kolejnych latach wprowadzono stopniowo diagnostykę serologiczną: pałeczek Salmonella enteritidis i Salmonella typhimurium oraz odległych taksonomicznie – Chlamydia trachomatis i Borrelia burgdorferi. O ile ww. dwa gatunki Salmonella dominują w krajowej populacji, o tyle pozostałe dwa drobnoustroje są opisywane jako odpowiedzialne za zespół SARA (sexually aquired reactive arthritis) oraz chorobę z Lyme.
Celem pracy była analiza badań serologicznych wykonywanych u pacjentów diagnozowanych w Instytucie Reumatologii (nie tylko hospitalizowanych) w kierunku obecności w surowicy przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3 oraz – co wydaje się niezwykle istotne diagnostycznie – określenie stopnia reakcji krzyżowych z pozostałymi ww. drobnoustrojami. Stanowi to podstawowy problem w postawieniu właściwej diagnozy i w następstwie – zastosowaniu odpowiedniej terapii. Okres tej analizy dotyczył lat 2004–2006.
Materiał i metody
Materiał do badań stanowiło 2846 surowic uzyskanych od 2833 pacjentów hospitalizowanych w IR, konsultowanych w Przychodni Przyklinicznej Instytutu Reumatologii, kierowanych przez lekarzy prywatnych i skierowanych z innych placówek medycznych – głównie Carolina Medical Center. Poszczególne liczby badanych surowic, pochodzących z różnych klinik/oddziałów IR oraz z innych źródeł, są przedstawione na rycinie 1. Jest to interesujące w kontekście liczby (%) uzyskanych wyników dodatnich, w porównaniu z liczbą zleceń, jak również np. hospitalizowanych osób w poszczególnych klinikach IR.
Poziom przeciwciał surowiczych dla Y. enterocolitica O3 był oznaczany metodą immunoenzymatyczną (ELISA), rutynowo stosowaną w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii [17] z użyciem komórek całych bakterii (proszek acetonowy) jako antygenu opłaszczającego płaskodenne dołki płytek polistyrenowych firmy Kartell S.p.A. (dystrybutor MEDLAB).
Stosowane w badaniach koniugaty: peroksydaza chrzanowa – immunoglobulina królicza skierowana przeciwko immunoglobulinie ludzkiej odpowiedniej klasy (A, G, M) pochodziły z firmy DAKO (Dania); były one rozcieńczane zgodnie z zaleceniami producenta. Substratem dla enzymu była o-fenyleno-dwuamina (firmy Sigma). W celu ustalenia norm dla poszczególnych klas Ig w ten sam sposób przebadano 80 surowic pochodzących od zdrowych dawców krwi i arbitralnie określano wyniki „+” jako x + 2 SD, „++” – x + 3 SD i „+++” – x + 4 SD, gdzie x oznaczał średnią wartość gęstości optycznej (O.D.) uzyskaną w badaniach surowic dawców, a SD odchylenie standardowe.
Wyniki
Analiza ryciny 1. wyraźnie wskazuje, że zwiększa się zarówno ogólna liczba badań w kierunku wykrywania przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3, jak i w poszczególnych latach. Zdecydowanie najczęściej dotyczyło to Kliniki Reumatologii Wieku Rozwojowego (KRWR), skąd pochodziła prawie połowa zleceń tych badań, a biorąc pod uwagę wyłącznie kliniki (oddziały) IR – odsetek badań wynosił prawie 60%. Zwraca uwagę fakt, że odsetek tzw. badań pozainstytutowych wynosił ok. 20% ogólnej liczby, z czego połowa dotyczyła zleceń Carolina Medical Center.
Biorąc pod uwagę te dane, świadczące o bardzo dużym zainteresowaniu klinicystów wykrywaniem przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3, niezwykle interesujące było prześledzenie odsetka wyników dodatnich (ryc. 2.).
Dane przedstawione na rycinie 2. wskazują na ogólnie małą wykrywalność przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3, niezależnie od badanej klasy immunoglobulin bądź źródła pochodzenia surowic. Zarówno w poszczególnych latach, jak i w całym okresie badawczym, poza nielicznymi wyjątkami, odsetek wykrytych wyników dodatnich kształtował się na poziomie poniżej 10%. I tak, w 2004 r. najrzadziej wykrywano dodatnie wyniki w surowicach pochodzących z grupy badań prywatnych i pracowników IR (2,9%) oraz pacjentów Kliniki Reumatologii (KR – 3,1%), najczęściej zaś w surowicach pacjentów konsultowanych w Poliklinice Dziecięcej (12,9%) i hospitalizowanych w Klinice Chorób Tkanki Łącznej (8,3%), a także skierowywanych z pozainstytutowych placówek medycznych (8,3%). W kolejnym – 2005 r. – ponownie mała wykrywalność (3%) dotyczyła KR, natomiast większa – KChR i KChTŁ (8%) oraz pacjentów konsultowanych w Poliklinice Przyklinicznej (Dorosłych) (9,1%).
Inną wykrywalność przeciwciał uzyskano w 2006 r.; w surowicach pacjentów Polikliniki Dorosłych oraz innych niż 4 reprezentatywne Kliniki IR (ryc. 2.) nie stwierdzono żadnego wyniku dodatniego, natomiast rekordowo największy odsetek (15,4%) pozytywnych rezultatów dotyczył surowic pacjentów innych placówek medycznych. W tej właśnie grupie pacjentów najczęściej w surowicach wykryto wyniki dodatnie (11,3%) w całym okresie badawczym, najrzadziej zaś w surowicach pacjentów Kliniki Reumatologii (3,7%) i w badaniach osób kierowanych prywatnie (3,4%).
Dane dotyczące obecności i poziomu przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3 odpowiednich klas immunoglobulin (IgA, IgG, IgM) są także interesujące (tab. I) – daje to obraz etapu spodziewanego zakażenia jersiniowego spowodowanego serotypem Y. enterocolitica. W minionym okresie badań, zgodnie z przypuszczeniem, zdecydowanie najczęściej wykrywano przeciwciała klasy IgG (59,9%), następnie klasy IgM (26,1%), a najrzadziej klasy IgA (14%). Wskazywało to najczęściej na prawdopodobieństwo odległej infekcji, ewentualnie na serokonwersję klasy IgM ® IgG, a zaledwie w ok. 1/4 przypadków można było brać pod uwagę niedawne zakażenie. Zgodnie z przypuszczeniami ponad 2-krotnie dominowały niewielkie poziomy badanych klas przeciwciał, co zawsze stanowi trudność diagnostyczną i sugeruje potrzebę dokonania po pewnym czasie kolejnych badań. Szczegółowe dane dotyczące poszczególnych lat przedstawiono w tabeli I. Skłoniły one autorów do analizy wyników dodatnich pod kątem współwystępowania przeciwciał trzech badanych klas immunoglobulin, co bardziej uwiarygodniłoby etap infekcji. Wyniki zbiorcze przedstawiono na rycinie 3.
Zarówno w poszczególnych latach, jak i w całym okresie badawczym zdecydowanie najczęściej (ok. 60%) w surowicach stwierdzano wyłącznie przeciwciała klasy IgG. Świadczyłoby to o infekcji Y. enterocolitica O3 przebytej co najmniej 6 mies. wcześniej, a być może nawet wiele lat wcześniej, ewentualnie o serokonwersji IgM ® IgG. Z kolei średni odsetek (16,1%) surowic z wynikami dodatnimi, tzn. przeciwciałami wyłącznie klasy IgM, sugerował wybitnie świeże (niedawne) zakażenie sprzed kilku tygodni (miesięcy). Inne warianty współwystępowania przeciwciał różnych klas były stwierdzane stosunkowo rzadko, a spośród nich najbardziej charakterystyczna dla reaktywnego zapalenia stawów jednoczesna obecność przeciwciał klas: IgG + IgA wykazana w ok. 6% surowic. Pozostałe warianty współwystępowania przeciwciał różnych klas były wykrywane w następujących odsetkach:
• IgA (–), IgG (+), IgM (+): średnio 7,7% – prawdopodobnie świeża infekcja,
• IgA (+), IgG (+), IgM (+): średnio 7,1% – prawdopodobnie świeża infekcja,
• IgA (+), IgG (–), IgM (–): średnio 3,2% – świeża infekcja lub indukcja przeciwciał przez stale przebywający drobnoustrój/strukturę antygenową.
Kolejnym, retrospektywnym etapem pracy było prześledzenie jednoczesnej obecności przeciwciał, różnych klas, dla Y. enterocolitica O3 oraz przeciwciał dla innych drobnoustrojów bakteryjnych w surowicy zlecanej do badań pochodzącej od tego samego pacjenta. Dotyczyło to drobnoustrojów odgrywających często kluczową rolę w wywoływaniu stanów zapalnych narządu ruchu, tj. dwóch gatunków Salmonella (S. enteritidis i S. typhimurium), Chlamydia trachomatis oraz Borrelia burgdorferi. Uczyniono to na podstawie obserwacji i danych z piśmiennictwa świadczących o częstych reakcjach krzyżowych, nawet między tak odległymi taksonomicznie bakteriami. Wyniki zgrupowano zgodnie ze zleceniami badań dokonywanych przez klinicystów, co czasami może świadczyć o niesprecyzowanym wywiadzie i prognozowaniu diagnostycznym (tab. II).
Szczegółowa analiza wyników przedstawionych w tabeli II zwraca uwagę na duży odsetek (ok. 25%) surowic dodatnich na obecność przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3, w których wykrywano jednocześnie przeciwciała dla innych drobnoustrojów – zarówno zbliżonych taksonomicznie (S. enteritidis, S. typhimurium), jak i odległych (Ch. trachomatis i B. burgdorferi). Ogółem na analizowane 102 surowice ze stwierdzonymi przeciwciałami dla serotypu Y. enterocolitica O3 aż 25 (24,5%) wykazywało dodatkowo obecność przeciwciał dla co najmniej 1 spośród 4 pozostałych gatunków drobnoustrojów. Ponieważ analiza dotyczyła surowicy tego samego pacjenta, badane surowice celowo pogrupowano wg zleceń lekarzy, stwierdzając niepokojące zjawisko częstego współwystępowania przeciwciał (różnych klas), co ogółem w 1/4 przypadków obniżało wartość diagnostyczną uzyskanych wyników.
Analizując poszczególne grupy zleceń badań (tab. II) i wyniki współwystępowania przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3 wraz z przeciwciałami dla pozostałych badanych drobnoustrojów, trudno w wielu przypadkach znaleźć logiczne wytłumaczenie. Na przykład w 12 surowicach badanych na obecność przeciwciał dla wszystkich 5 drobnoustrojów, wykazano obecność 7 surowic (58,3%) z reakcjami krzyżowymi, w tym „wariant”: Y. enterocolitica O3 + Ch. trachomatis stwierdzono aż w 4 surowicach. W 22 surowicach, w których zlecano badania przeciwciał dla 4 drobnoustrojów, wykazano duży (40,9%) odsetek reakcji krzyżowych (z przewagą Y. enterocolitica O3 + Ch. trachomatis i Y. enterocolitica O3 + S. enteritidis). Chociaż tylko w 7 surowicach badano występowanie przeciwciał jedynie przeciw Y. enterocolitica O3 + B. burgdorferi, to aż w 4 przypadkach (57,1%) stwierdzono współwystępowanie przeciwciał dla obu bakterii. Ogólnie obecność przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 wiązała się kolejno z obecnością jednocześnie przeciwciał dla: Ch. trachomatis – 19,5%, surowic, B. burgdorferi – 10,6%, S. enteritidis – 5,7% a S. typhimurium – 1,1%. Odsetki te dotyczyły surowic (25%) z co najmniej jedną stwierdzoną reakcją krzyżową.
Nie stwierdzono różnic między klasami wykrywanych przeciwciał dla współwystępujących drobnoustrojów. Najczęściej były to – po równo – klasa IgG i IgM (tab. II). W niektórych przypadkach można podejrzewać serokonwersję IgM ® IgG, co mogłoby sugerować podejrzenie zakażenia odpowiednim drobnoustrojem na etapie wcześniejszym (odpowiedź w klasie IgM).
Omówienie wyników
Zlecanie badań serologicznych Y. enterocolitica O3 przez klinicystów zarówno Instytutu Reumatologii w Warszawie, jak i innych warszawskich i pozawarszawskich placówek medycznych było bardzo zróżnicowane w omawianym okresie. Przedstawiono to na rycinie 1., na podstawie której można wysnuć zastanawiający wniosek, że populacja dzieci (KRWR) stanowiła ok. 50% wszystkich badanych pacjentów. Nasuwa się pytanie, czy chore dzieci powinny tak często być badane w kierunku obecności przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3, czy objawy chorobowe i wywiad lekarski dobitnie wskazywały na taką konieczność, ponieważ w badaniach autorów [18] w grupie zdrowych dawców krwi wykryto obecność tych przeciwciał w odsetkach 3–5%, w zależności od stosowanego antygenu w metodzie ELISA (całe bakterie, LPS, OMP). W poszczególnych grupach chorych z różnych miejsc (ryc. 2.) wykazano zaś obecność przeciwciał w surowicy średnio poniżej 10%, a w KRWR, na którą szczególnie zwracano uwagę, odsetek ten wynosił 5,9%. Interesujące, że wśród pacjentów pozainstytutowych odsetek ten był najwyższy, tzn. 11,3%, a w grupie badań prywatnych – najniższy – 3,4%. Czy na taki obraz (szczegóły na ryc. 2.) wykrywalności przeciwciał nie wpływały czynniki subiektywne, m.in. wnikliwość wywiadu, doświadczenie zlecającego itp.?
Prezentowane w niniejszej pracy badania dotyczyły obecności przeciwciał tylko dla jednego spośród ok. 60 serotypów Y. enterocolitica O3, a więc siłą rzeczy można było spodziewać się tak małej częstotliwości wykrywanych przeciwciał. Osoba zlecająca takie badania powinna mieć świadomość, iż w piśmiennictwie światowym i krajowym [9, 13] podkreślany jest udział w indukowaniu stanów zapalnych narządu ruchu innych serotypów, spośród których Y. enterocolitica O9 i O8 są najczęściej wymieniane. Być może w przyszłości dołączą do nich inne serotypy o cechach „artritogennych”, ale obecnie siłą rzeczy badania światowe dotyczące chorób reumatycznych skupiają się na tych kilku serotypach. Nie można wykluczyć w niedalekiej przyszłości również częstszych badań nad znaczeniem innego gatunku – Y. pseudotuberculosis. Tego typu eksperymenty rozpoczęto również w 2007 r. w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii IR, ale wymagają one potwierdzenia swoistości przeciwciał metodą Western-Blot, a przede wszystkim korelacji z obrazem klinicznym.
Autorzy pracy obawiają się, że w wielu przypadkach klinicznych lekarze nie biorą pod uwagę, iż ukierunkowują badanie na wykrycie bardzo konkretnych przeciwciał dla jednego serotypu, który w populacji krajowej występuje stosunkowo rzadko, stąd wypływa potencjalnie mała diagnostycznie przydatność otrzymanego wyniku, sięgająca w naszych badaniach (wszystkich zleconych w ciągu 3 lat) średnio 5,5%; na 2846 badań stwierdzono 156 wyników dodatnich, niezależnie od wykrywanej klasy immunoglobulin.
Hasło na zleceniu „Yersinia” ma zatem bardzo ograniczoną wartość, nie mówiąc o ekonomicznej stronie badań i ewentualnej terapii antybiotykami, przeważnie krytycznie ocenianej w piśmiennictwie światowym [19–21].
Z leczeniem antybiotykami wiąże się potrzeba identyfikacji zakażenia wywołanego m.in. przez Yersinia sp., prawdopodobnie indukującego reaktywne zapalenie stawów. Według Fendlera i wsp. [13] oprócz obecności asymetrycznego zapalenia stawów i/lub dodatniego posiewu z kału wymagane są pewne serologiczne kryteria, takie jak:
• poziom przeciwciał dla Yersinia w klasie IgG ł3 SD + obecne przeciwciała IgA lub IgM,
• poziom przeciwciał IgG ł2 SD + obecne przeciwciała IgA lub IgM + objawy enterocoli.
Komentarzem do tych kryteriów mogą być wnioski wysunięte z obecnych badań nad występowaniem poziomów przeciwciał poszczególnych klas i ich współwystępowanie (ryc. 3., tab. I). Biorąc pod uwagę najczęstsze występowanie przeciwciał przeciwko Yersinia jedynie klasy IgG, aż w ok. 60% przypadków można było wg sugestii przedstawionych w pracy Rihl i wsp. [4] domniemywać o dość odległej infekcji, czyli o ograniczonej diagnostycznej wartości. Łączy się z tym zjawiskiem zastosowanie terapii antybiotykami, które jest sugerowane na etapie aktywnej lub niedawnej infekcji [8], a któremu towarzyszy jednoczesne występowanie przeciwciał klas IgG + IgM (w badaniach przedstawionych w niniejszej pracy stwierdzone zaledwie średnio w 7,7%) oraz IgG + IgA (zaledwie średnio w 5,8%). Zwłaszcza wariant IgG + IgA jest opisywany jako najbardziej charakterystyczny u chorych, u których rozpoczyna się zapalenie stawów, z możliwością występowania żywych drobnoustrojów Yersinia lub ich struktur antygenowych, głównie na błonach śluzowych i w węzłach chłonnych krezki. Dlatego w wysoko wyspecjalizowanych ośrodkach badawczych [22, 23] oznacza się podklasy IgA1, A2 dla Y. enterocolitica i komponent wydzielniczy s-IgA, w przypadkach podejrzenia zakażenia tą bakterią z towarzyszącymi objawami stawowymi. W warunkach instytutowych, ze względów ekonomicznych oraz z powodu niezbyt do końca pewnej wartości diagnostycznej, takie drogie badania nie mogą być brane pod uwagę poza aspektem naukowym. Trzeba nadmienić, że przeciwciała klasy IgA mają kilkudniowy okres półtrwania, a więc ich obecność może świadczyć zarówno o niedawnej infekcji, jak i o stanie przewlekłym z ciągłą indukcją tych przeciwciał przez zasiedlający drobnoustrój.
Z kolei występowanie wyłącznie przeciwciał klasy IgM, choć dość częste (16,1%), z jednej strony świadczy o niedawnej infekcji (sprzed kilku tygodni), z drugiej strony zgodnie z obserwacjami ich poziom obniża się najczęściej w okresie 3–6 tyg. (serokonwersja do klasy IgG), kiedy często jeszcze nie w pełni rozwijają się objawy kliniczne zapalenia stawów. Trzeba też brać pod uwagę ewentualne fałszywie dodatnie wyniki spowodowane obecnością RF.
Wielce niepokojącym zjawiskiem, z punktu widzenia wiarygodności diagnostyki serologicznej w kierunku Y. enterocolitica O3, okazały się w 1/4 surowic tzw. dodatnich reakcje krzyżowe z innymi drobnoustrojami, istotnymi w wywoływaniu reaktywnych zapaleń stawów: S. enteritidis, S. typhimurium, Ch. trachomatis i B. burgdorferi.
Bardzo dokładne wyniki uzyskane po analizie 102 surowic pobranych od pojedynczych pacjentów przedstawiono w tabeli II, grupując je wg zleceń lekarskich. Podstawą grupowania był dodatni wynik badania na obecność przeciwciał przeciw Y. enterocolitica, a w dalszej kolejności uzyskany wynik serologicznego badania dla innych ww. drobnoustrojów. Wnikliwa analiza rezultatów poszczególnych grup zleconych badań w 24,5% wykazała reakcje krzyżowe i na tym etapie nie pozwalała klinicyście na jednoznaczne sprecyzowanie, z jakim faktycznie drobnoustrojem można wiązać podejrzewane zakażenie bakteryjne z jego powikłaniami stawowymi. Nie można było wykluczyć również bardzo odległych infekcji bądź świeżych nadkażeń, do czego służyła analiza współwystępujących przeciwciał różnych klas immunoglobulin.
Mimo że praca ma charakter praktyczny, to należy odnieść się również do danych z piśmiennictwa i powodów występowania tak powszechnego zjawiska reakcji krzyżowych. Wynikają one z budowy antygenowej ściany komórkowej poszczególnych drobnoustrojów, które w różnym stopniu zostały ocenione w metodzie ELISA. Nie były zaskoczeniem krzyżowe reakcje serologiczne między Y. enterocolitica O3 a S. enteritidis i S. typhimurium. Już w 1988 r. Paerregard i wsp. [11] przy użyciu metody ilościowej immunoelektroforezy udowodnili obecność antygenów tego serotypu w znacznym stopniu krzyżowo reagujących z innymi Gram-ujemnymi pałeczkami z rodziny Enterobacteriaceae, do których zalicza się Salmonella. Wykazano też w niewielkim stopniu krzyżową reaktywność także z Pseudomonas, Neisseria meningitidis.
W LPS Y. enterocolitica O3 stwierdzano obecność antygenu (nr 71), który stanowi znaczną jego część, odpowiadającą za krzyżowe reakcje z innymi Gram-ujemnymi bakteriami. Badania innych autorów skupiały się na poszukiwaniu składników antygenowych ściany komórkowej Y. enterocolitica, które odpowiadałyby za krzyżową reaktywność. Stwierdzono je m.in. w białkach OMP [24], ciepłostałej enterotoksynie [25], antygenie ECA [26] oraz pewnych antygenach krzyżowo reagujących z antygenem HLA-B27 [27]. Już dawno zatem wykazano potencjalną możliwość występowania częstego zjawiska krzyżowych reakcji między Yersinia a pałeczkami Gram-ujemnymi. Wydaje się, że głównym antygenem za to odpowiedzialnym jest wysoce immunogenny LPS, z jego O-polisacharydowym łańcuchem. Wyżej wymienione badane składniki antygenowe są integralną częścią ściany komórkowej pałeczek Gram-ujemnych, w tym Enterobacteriaceae. Nie dziwi więc fakt, że użyty w metodzie ELISA antygen całych bakterii Y. enterocolitica O3 mógł wykrywać przeciwciała dla innych drobnoustrojów, w tym S. enteritidis i S. typhimurium, dla tych których przeciwciała stwierdzano przy zastosowaniu swoistego antygenu LPS. Antygen LPS mógł jednakże zawierać składniki O-polisacharydu krzyżowo reagujące z przeciwciałami dla Y. enterocolitica O3. Reaktywność ta była jednak nieznaczna, tj. w przypadku S. enteritidis wyniosła 5,7%, a S. typhimurium – zaledwie 1,1%.
Zdecydowanie częściej (10,6%) wykazywano jednoczesne występowanie przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3 i B. burgdorferi, tak odległych taksonomicznie i zupełnie niezwiązanych ani formami klinicznymi, ani wektorami transmisji. W obu drobnoustrojach występuje w ścianie komórkowej błona zewnętrzna (OMP) o wybitnie białkowym charakterze (u B. burgdorferi >100 polipeptydów) i LPS (lub LPS-like u Borrelia). Wydaje się, że zwłaszcza immunogenne białka OMP obu drobnoustrojów mogą być główną przyczyną reakcji krzyżowych objawiających się produkcją przeciwciał klasy IgM i/lub IgG (tab. II). Skłaniają do takiego przypuszczenia użyte w metodzie ELISA wykrywającej przeciwciała przeciw B. burgdorferi rekombinowane białkowe antygeny, głównie pochodzenia OMP. Na fazie stałej opłaszczone były następujące białka: OspC (powierzchniowe białko, wysoce swoiste, dające odpowiedź humoralną wczesną, zwłaszcza w klasie IgM), p100 i p18 (wysoce swoiste dla fazy III zakażenia, szczególnie związane z indukowaniem przeciwciał IgG) i p41 (białko strukturalne endoflagelliny, nieswoiste, charakterystyczne dla I fazy zakażenia) [28]. Bogata „mozaika” antygenowa użytych całych bakterii Y. enterocoloitica O3, a więc mająca zarówno LPS, jak i OMP ściany komórkowej, mogła zawierać bardzo zbliżone epitopy, wobec których stwierdzono obecność przeciwciał.
Oczywiście w przypadku serologicznych reakcji krzyżowych ww. drobnoustrojów nie można wykluczyć nadkażenia jednym z nich, ale tym bardziej wymaga to skrupulatnej analizy klinicznej i potwierdzenia dodatniego serologicznego wyniku swoistą metodą Western-Blot. Czyni się to obecnie w odniesieniu do B. burgdorferi, a planuje dla Y. enterocolitica i Ch. trachomatis, co jednak wyraźnie podraża diagnostykę, lecz w wielu ujemnych serologicznie przypadkach powinno eliminować terapię antybiotykami.
Zdecydowanie najczęściej w analizowanym materiale występowały jednocześnie przeciwciała przeciw Y. enterocolitica O3 i Ch. trachomatis. Dotyczyło to aż 19,5% surowic (tab. II), w których wykryto te przeciwciała i to wyłącznie w klasie IgG. Wskazuje to na uprzednio zaistniałą infekcję, ma zatem dodatkowo ograniczoną wartość diagnostyczną.
Być może pacjenci ze stwierdzoną taką krzyżową odpowiedzią humoralną przeszli zakażenie tymi gatunkami drobnoustrojów, które w tamtym momencie mogły indukować stany zapalne narządu ruchu.
Wykrywana krzyżowa reaktywność może wynikać z budowy antygenowej zastosowanych w metodzie ELISA, opłaszczających fazę stałą, ciałek elementarnych (EB) Ch. trachomatis. Zawierają one grupowo swoiste (dla wszystkich Chlamydia) ciepłostałe kompleksy lipoproteinowo-węglowodanowe z kwasem 2-keto-3-deo-ksyoktonowym (KDO) jako dominującym komponentem immunogennym. Są one składnikiem LPS. Niektóre antygeny swoiste gatunkowo i immunotypowo (Ch. trachomatis ma 15 immunotypów) mają charakter białkowy, tworząc zewnętrzną część ściany komórkowej MOMP (major outer membrane proteins) [29]. Ch. trachomatis, tak jak Y. enterocolitica, ma 2 podstawowe składniki ściany komórkowej, tj. LPS osadzony wewnątrz OMP. Oba zatem drobnoustroje mogą mieć zbliżone epitopy antygenowe, wobec których produkowane są przeciwciała.
Wnioski
Wszystkie badania, ich rezultaty oraz dane z piś-miennictwa pozwalają na wysunięcie kilku wniosków o charakterze ogólnym. Powinny one zwrócić uwagę klinicystów reumatologów na praktyczny aspekt zlecanych badań w kierunku występowania przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 i/lub innych drobnoustrojów, które mogą mieć związek z chorobami narządu ruchu:
• wykrywana liczba (%) wyników dodatnich na obecność przeciwciał dla jednego z nielicznych serotypów chorobotwórczych Yersinia O3 nie odbiegała ilościowo od stwierdzanych w zdrowej populacji i w znacznym stopniu obniżała wartość diagnostyczną zbadanych w latach 2004–2006 ok. 3000 surowic uzyskanych od chorych, z których ok. 50% stanowiły dzieci i młodzież; wykrywalność przeciwciał średnio w 5,5% (3–11% w zależności od analizowanej grupy) każe zastanowić się nad aspektem ekonomicznym badań,
• wartość diagnostyczną uzyskanych wyników dodatnich na obecność przeciwciał przeciw Y. enterocolitica O3 dodatkowo zdecydowanie obniżało jednoczesne występowanie przeciwciał dla innych drobnoustrojów S. enteritidis, S. typhimurium, B. burgdorferi, a zwłaszcza Ch. trachomatis, tak odległych taksonomicznie, różniących się formami klinicznymi i wektorami transmisji; w 1/4 dodatnich surowic badanych na obecność przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 wykazano przeciwciała przeciwko przynajmniej jednemu z ww. drobnoustrojów,
• uzyskane wyniki sugerują klinicystom reumatologom niezwykle wnikliwe analizowanie każdego przypadku chorobowego z dodatnim wynikiem serologicznym (również w aspekcie stwierdzanych klas przeciwciał) i retrospektywne podejście do wywiadu; „odważna” diagnoza na podstawie wymienionych zastrzeżeń może implikować niewłaściwą terapię, w tym antybiotykami, zwłaszcza zdecydowana dominacja przeciwciał klasy IgG dla Y. enterocolitica O3 bez wyraźnych korelacji z aktualnym i uprzednim obrazem klinicznym w wielu przypadkach może wynikać jedynie z kontaktu pacjenta z tym drobnoustrojem.
Piśmiennictwo
1. Granfors K, Merilakti-Palo R, Luukkainen R, et al. Persistance of yersinia antigens in peripheral blood cells from patients with Yersinia enterocolitica O3 infection with or without reactive arthritis. Arthritis Rheum 1998; 41: 855-862.
2. Nanagora R, Li F, Beutler A, et al. Alteration of Chlamydia trachomatis biologic behavior in synovial membranes. Suppression of surface antigen production in reactive arthritis and Reiter’s syndrome. Arthritis Rheum 1995; 38: 1410-1417.
3. Gerard HC, Branigan PJ, Schumacher HR, Hudson AP. Synovial Chlamydia trachomatis in patients with reactive arthritis (Reiter’s syndrome are viable but show abberant gene expression). J Rheumatol 1998; 25: 734-742.
4. Rihl M, Klos A, Kõhler L, Kuipers JG. Reactive arthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol 2006; 20: 1119-1137.
5. Gerard HC, Wang Z, Wang GF, et al. Chromosomal DNA from a variety of bacterial species is present in synovial tissue from patients with various forms of arthritis. Arthritis Rheum 2001; 44: 1689-1697.
6. Jalova J, Skurnik M, Toivanen A, et al. Bacterial PCR in the diagnosis of joint infection. Ann Rheum Dis 2001; 60: 287-289.
7. Flores D, Marquez J, Garza M, Espinoza LR. Reactive arthritis: newer developments. Rheum Dis Clin Am 2003; 29: 37-59.
8. Gaston JSH, Lillicrap MS. Zapalenia stawów związane z zakażeniami jelitowymi. Best Prac Res Clin Rheumatol (Clin Rheumatol – wydanie polskie) 2004; 1: 4-14.
9. Rastawicki W, Jagielski M, Gierczyński R i wsp. Udział pałeczek z rodzaju Salmonella i Yersinia w patogenezie zapalenia stawów ze szczególnym uwzględnieniem spondyloartropatii i reumatoidalnego zapalenia stawów. II. Występowanie przeciwciał dla pałeczek Salmonella i Yersinia w surowicy i płynie stawowym osób z zapaleniem stawów. Med Dośw Mikrobiol 2005; 57: 143-151.
10. Brasse-Rumin M, Noworyta J, Ząbek J. Nieswoiste reakcje serologiczne w diagnostyce chorób narządu ruchu podejrzewanych o etiologię infekcyjną. Reumatologia 2004; 42: 31-37.
11. Paerregaard A, Eespersen F, Høiby N. Cross-reactions between Yersinia enterocolitica serogroup O3 and other serogroups of the same species, as well as thirty – four other bacterial species. APMIS 1988; 96: 315-324.
12. Nurminen M, Leinonen M, Saikku P, Makela PM. The genus – specific antigen of Chlamydia; resemblance to the lipopolysaccharide of enteric bacteria. Science 1983; 220: 1279-1281.
13. Fendler C, Laitko S, Sörensen H, et al. Frequency of triggering bacteria in patients with reactive arthritis and undifferentiated oligoarthritis and the relative importance of the tests used for diagnosis. Ann Rheum Dis 2001; 60: 337-343.
14. Lahesmaa-Rantala R, Stahlberg TH, Granfors K, et al. Serological cross-reactions against Yersinia entererocolitica in patients infected with other arthritis – associated microbes. Clin Exp Rheumatol 1990; 8: 5-9.
15. Sobieszczańska BM. Rola artrytogennych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae oraz Borrelia burgdorferi w patomechanizmie reaktywnego zapalenia stawów (REA). Post Mikrobiol 1997; 36: 101-121.
16. Noworyta J. Zakażenia bakteryjne i ich rola w indukcji i przebiegu chorób reumatycznych. Reumatologia 1996; 34: 800-811.
17. Noworyta J, Ząbek J, Brasse-Rumin M, Gago J. Odpowiedź humoralna na wybrane złożone antygeny bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz ich subkomponenty badana w surowicy i płynie stawowym pacjentów z chorobami narządu ruchu. Reumatologia 2003; 41: 259-268.
18. Noworyta J, Ząbek J, Brasse-Rumin M, Brzezicki J. Odpowiedź humoralna na wybrane antygeny pałeczek Gram-ujemnych w chorobach narządu ruchu. Reumatologia 2001; 39: 29-41.
19. Smieja M, MacPherson DW, Kean W, et al. Randomised, blinded, placebo controlled trial of doxycycline for chronic seronegative arthritis. Ann Rheum Dis 2001; 60: 1088-1094.
20. Sieper J, Fendler C, Laitko S, et al. No benefit of long-term ciprofloxacin treatment in patients with reactive arthritis and undifferentiated oligoarthritis. Arthritis Rheum 1999; 42: 1386-1396.
21. Kvien TK, Gaston JS, Bardin T, et al. Three-month treatment of reactive arthritis with azithromycin: a EULAR double blind, placebo controlled study. Ann Rheum Dis 2004; 63: 1113-1119.
22. Delacroix DL, Dive C, Rambaud IC, Vaerman IP. IgA subclasses in various secretions and in serum. Immunology 1982; 47: 383-385.
23. de Koning J, Heesemann J, Hoogkamp-Korstanje JA, et al. Yersinia in intestinal biopsy specimens from patients with seronegative spondyloarthropathy: correlation with specific serum IgA antibodies. J Infect Dis 1989; 159: 109-112.
24. Hofstra H, Dankert J. Antigenic cross-reactivity of major outer membrane proteins in Enterobacteriaceae species. J Gen Microbiol 1979; 111: 293-302.
25. Okumoto K, Miyama A, Takeda Y, et al. Cross-neutralization of heat-stable enterotoxin activity of enterotoxigenic Escherichia coli and of Yersinia enterocolitica. FEMS Microbiology Letters 1983; 16: 85-87.
26. Maeland IA, Digranes A. Common enterobacterial antigen in Yersinia enterocolitica. Acta Pathol Microbiol Scand Sect B 1975; 83: 382-386.
27. Van Bohemen CG, Grumet FC, Zanem HC. Identification of HLA-B27M1 and –M2 cross-reactive antigens in Klebsiella, Shigella and Yersinia. Immunology 1984; 52: 607-610.
28. Zaremba ML, Borowski J. Mikrobiologia Lekarska. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1997; 331.
29. Jawetz E, Melnick IL, Adalberg EA. Przegląd Mikrobiologii