Original paper
Epidermal proliferation and intracellular adhesion impairment as one mode of action of ultraviolet-B radiation

Wprowadzenie

Promieniowanie słoneczne jest najpowszechniejszym czynnikiem środowiskowym, oddziałującym na organizm ludzki. Spośród słonecznego ultrafioletu docierającego na powierzchnię Ziemi ok. 5% stanowi promieniowanie ultrafioletowe typu B (UVB), a 95% – promieniowanie ultrafioletowe typu A (UVA), które w porównaniu z UVB jest ok. 1000 razy mniej mutagenne [1]. Do odległych niekorzystnych działań promieniowania ultrafioletowego (ultraviolet radiation – UVR) zalicza się przyspieszone starzenie się skóry (photoaging) oraz rozwój nowotworów, głównie niemelanocytowych raków skóry. Zdolność UVR do indukowania tych procesów bez wątpienia wiąże się z jego właściwościami immunomodulującymi, prowadzącymi do zjawiska fotoimmunosupresji, a w konsekwencji do fotokancerogenezy [2, 3].
Markerem aktywności proliferacyjnej komórki jest antygen jądrowy Ki-67. Wykazano, że ekspresja Ki-67 pojawia się nieprzerwanie we wszystkich stadiach cyklu komórkowego z wyjątkiem fazy G0, w której komórka pozostaje w stanie spoczynku. Komórki zatrzymane w cyklu komórkowym od G0 do wczesnej fazy G1 nie mają antygenu Ki-67 [4]. Dotychczas pojedyncze prace analizowały wpływ UVR na poziom ekspresji Ki-67. Edström i wsp. [5] odnotowali istotne zwiększenie ekspresji tego białka w skórze poddanej przewlekłej ekspozycji na małe dawki UVA-1. Autorzy sugerują, że promieniowanie to powoduje istotny wzrost aktywności proliferacyjnej komórki, oraz pośrednio wskazują, że małe nierumieniotwórcze dawki UVA-1 mogą powodować uszkodzenie DNA i dysregulację cyklu komórkowego.
Główną rolę w adhezji komórkowej odgrywa kompleks b-kateniny z kadheryną E, biorący również udział w regulacji prawidłowego przekazu sygnałów komórkowych. W komórkach prawidłowych ekspresję tej proteiny stwierdza się w obrębie błony komórkowej [6].
Kateniny stanowią podobne do siebie pod względem struktury białka cytoplazmatyczne, które metodą elektroforezy podzielono na formy a, β i g. Pełnią one istotną funkcję w adhezji komórkowej oraz w organizacji cytoszkieletu. Dodatkowo b-katenina bierze udział w regulacji ekspresji genów szlaku transdukcji sygnałów komórkowych zaangażowanych w proces onkogenezy. Prawidłowe komórki naskórka wykazują obecność tego białka w obrębie błony komórkowej, podczas gdy w nowotworach dochodzi do dysregulacji jej ekspresji, polegającej na zmniejszeniu liczby komórek b-kateniny (+) bądź też na translokacji białka z błony komórkowej do cytoplazmy lub jądra. W badaniach ostatnich lat wskazuje się, że uszkodzenie prawidłowej funkcji kompleksu adhezyjnego E-kadheryna/b-katenina w nowotworach prowadzi do ich większej agresywności i przerzutowości [7].
Wpływ UVR na procesy proliferacyjne i adhezję komórek nie jest w pełni poznany. Celem pracy była więc ocena ekspresji białka Ki-67 oraz b-kateniny w naskórku osób zdrowych poddanych ekspozycji na różne dawki UVR.

Materiał i metody

Materiał
W celu określenia wpływu zróżnicowanych dawek UVR na analizowane parametry oceniane metodą immunohistochemiczną do badań zakwalifikowano 26 zdrowych wolontariuszy (14 kobiet, 12 mężczyzn, średnia wieku 50,2 roku) z I–IV fototypem skóry ocenianym wg skali Fitzpatricka [8]. Każdy zdrowy ochotnik wyraził pisemną zgodę na udział w badaniu. Wolontariusze byli ogólnie zdrowi i nie przyjmowali żadnych leków. Do badania nie kwalifikowano osób, które 2 mies. przed rozpoczęciem eksperymentu korzystały z solariów bądź były poddane zwiększonej ekspozycji słonecznej.
Wolontariuszy podzielono na cztery grupy (grupy 1.–4.) w zależności od stosowanego schematu naświetlań. Dziewięciu zdrowych wolontariuszy naświetlano przewlekłymi i nierumieniotwórczymi dawkami UVB przez 10 kolejnych dni (10 × 0,7 MED – całe ciało) i stanowiło grupę 1. Kolejnych 9 ochotników eksponowano przez 10 kolejnych dni na przewlekłe i nierumieniotwórcze dawki UVB (10 × 0,7 MED – całe ciało), a następnie naświetlano aplikowaną miejscowo (10 × 10 cm, skóra pośladka) dużą dawką UVB (3 MED) – grupa 2.
Wolontariuszy z grupy 3. (n = 4) poddawano pojedynczej, miejscowo aplikowanej (skóra pośladka 10 × 10 cm) ekspozycji na rumieniotwórczą dawkę 3 MED. Dodatkowo 4 zdrowych ochotników (grupa 4.) stanowiło nienaświetlaną grupę kontrolną do przeprowadzonych analiz immunohistochemicznych. Od wszystkich ochotników z grup 1.–4. pobierano wycinki skóry przy zastosowaniu sztancy o średnicy 4 mm. Poza grupą kontrolną (grupa 4.) biopsje skóry w grupach 1.–3. pobierano 24 godz. po ostatnim naświetlaniu. Charakterystykę kliniczną pacjentów i wolontariuszy (grupy 1.–4.) włączonych do analiz immunohistochemicznych przedstawiono w tab. 1.
Promieniowanie ultrafioletowe typu B
Źródło UVB generowały lampy 100W typu B12 (Philips, Eindhoven, Holandia), emitujące spektrum UVB w zakresie długości fali 285–340 nm. Natężenie promieniowania na powierzchni skóry przy odległości obiektu 20 cm od świetlówek wynosiło 3,85 mW/cm². Pomiaru natężenia dokonywano miernikiem typu UV meter (Typ I) (Waldmann Medizintechnik, Villingen-Schwenningen, Niemcy).
Miejscowe naświetlanie UVB (dawka 3 MED) i fototesty dla UVB wykonano przy zastosowaniu lampy UV 109 (Waldman Medizintechnik, Vilingen-Schwenningen, Niemcy), emitującej UVB w zakresie 280–360 nm, przy maksimum emisji w paśmie 310 nm. Natężenie emitowanego promieniowania mierzono przy użyciu miernika promieni UV (Waldman Medizintechnik W, UV21, Villingen-Schwenningen, Niemcy) w spektrum 285–350 nm.
Próby świetlne
Fototesty wykonywano w grupach 1–4 w obrębie skóry pleców. Naświetlań dokonywano zwiększającymi się dawkami UVB w obrębie 6 pól o wymiarach 1 × 1 cm. Dawka wstępna określana na podstawie wywiadu, badania klinicznego i fototypu skóry wynosiła 0,01–0,09 J/cm². Najmniejszą dawkę UVR, która po 24 godz. powodowała jednolity, miernie nasilony rumień w całym naświetlanym polu określono jako minimalną dawkę rumieniową (minimal erythema dose – MED).
Metodyka oznaczeń immunohistochemicznych
Pobrane tkanki umieszczano w 10-procentowym roztworze formaldehydu i zatapiano w parafinie, a następnie krojono na skrawki o grubości 2–3 mm, na których przeprowadzano odczyny immunohistochemiczne. Po odparafinowaniu w szeregu ksylenów i odwodnieniu w szeregu alkoholi, skrawki płukano w kilku zmianach wody destylowanej. W celu odzyskania antygenowości tkanek oraz otwarcia drogi dla przeciwciał skrawki gotowano w buforze odsłaniającym o pH 6,9 lub 11 (Dako Cytomation, Target Retrieval Solution – TRS) w kuchence mikrofalowej przy następujących poziomach mocy: 360 W (2 × 6 min), 180 W (2 × 5 min) i 90 W (2 × 5 min). Po wystudzeniu skrawki płukano 2-krotnie w 0,05-molowym buforze TRIS (Tris-buffered saline – TBS, Dako Cytomation) o pH 7,6 przez 5 min. W celu zablokowania aktywności endogennej peroksydazy skrawki inkubowano przez 30 min w 0,3-procentowym roztworze nadtlenku wodoru (H₂O2). Następnie poddano je całonocnej inkubacji z pierwotnymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom – Ki-67 i b-katenina (tab. 2.). Przeciwciała pierwotne rozpuszczono w rozcieńczalniku zawierającym komponentę blokującą tło (Dako Cytomation, Antibody Diluent with Background Reducing Components). Inkubację przeprowadzono w komorze wilgotnej w temperaturze 4°C. Po inkubacji skrawki 2-krotnie płukano w buforze TBS, a następnie, aby uwidocznić reakcję antygen-przeciwciało, stosowano odpowiednie systemy detekcyjne EnVision/HRP/DAB+ dla mysich oraz króliczych przeciwciał pierwotnych (Dako Cytomation). Po 30-minutowej inkubacji skrawków z użyciem wtórnego przeciwciała znakowanego peroksydazą chrzanową, przeprowadzano reakcję enzymatyczną, stosując substrat dla peroksydazy – tetrachlorek 3,3’-diaminobenzydyny (DAB). Szczegółową charakterystykę stosowanych przeciwciał przedstawiono w tab. 3. Po zakończeniu reakcji immunohistochemicznej jądra komórkowe podbarwiano hematoksyliną wg Meyera (2 min), a następnie preparaty odwadniano w szeregu alkoholi o zwiększających się stężeniach, przeprowadzano przez szereg ksylenów i zatapiano w medium. Stosując powyżej opisaną procedurę immunohistochemiczną, kontrolę negatywną stanowiły skrawki, w których pierwotne przeciwciało zastąpiono buforem TBS. Następnie preparaty podbarwiano hematoksyliną, odparowywano i przykrywano szkiełkami nakrywkowymi. Liczbę komórek wykazujących ekspresję jądrową (Ki-67) i błonową (b-katenina) poszczególnych białek zliczano w powiększeniu 400× przy zastosowaniu programu komputerowego SIS analysis (Olympus, Japonia). U każdego ochotnika w naskórku obliczano średnią liczbę komórek z dodatnią ekspresją badanych białek na 100 analizowanych komórek w trzech różnych polach widzenia.
Analiza statystyczna
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu oprogramowania Statistica v. 6.1. W celu porównań statystycznych, poza obliczeniem średniej arytmetycznej i odchylenia standardowego, posłużono się obliczeniem mediany, dolnego i górnego kwartyla. Do oceny istotności różnic badanych parametrów między dwoma grupami zastosowano test U Manna-Whitneya. Za znamienny statystycznie poziom istotności we wszystkich analizach przyjęto p < 0,05.

Wyniki

Białko Ki-67
W wycinkach pobranych od wolontariuszy naświetlanych przez 10 dni dawką 0,7 MED UVB (grupa 1.) liczba komórek wyrażona w medianach Ki-67(+) wynosiła 5,7/100 komórek, u wolontariuszy z grupy 2. – 11,3/100 komórek, z grupy 3. – 6,3/100 komórek. W grupie kon- trolnej stwierdzono najmniejszą liczbę komórek Ki-67(+) – 3,5/100 komórek (tab. 3., ryc. 1.).
Analizując liczbę komórek Ki-67 (+) w poszczególnych grupach, wykazano istotnie statystycznie większą ich liczbę w wycinkach pobranych w grupach 1.–3. (odpowiednio p = 0,48, p = 0,003, p = 0,04) w porównaniu z grupą kontrolną. Odnotowano także istotnie większą liczbę komórek Ki-67(+) w grupie 2. niż w grupie 1. (p < 0,001), a także w grupie 2. niż w grupie 3. (p = 0,006).
b-Katenina
W wycinkach pobranych od wolontariuszy z grupy 1. liczba komórek z ekspresją b-kateniny wyrażona jako mediana wynosiła 95/100 komórek, z grupy 2. – 96,5/100 komórek, z grupy 3. – 95,7/100 komórek, a w grupie kontrolnej – 100/100 komórek (tab. 3., ryc. 2.).
Analizując liczbę komórek wykazujących ekspresję b-kateniny w poszczególnych grupach w odniesieniu do grupy kontrolnej, wykazano istotnie mniejszą ich liczbę w wycinkach pobranych od osób z grup 1.–3. (p < 0,05 dla wszystkich porównań).
Nie stwierdzono różnic między ekspresją b-kateniny między naświetlanymi grupami (p > 0,05 dla wszystkich porównań).

Omówienie wyników

Antygen jądrowy Ki-67 jest wyznacznikiem aktywności proliferacyjnej komórki, a ocena poziomu jego ekspresji może być wykorzystywana w celu określenia populacji komórek będących w fazie wzrostu [4]. Wykazano, że antygenowa ekspresja tego markera proliferacji wzrasta w kolejnych fazach cyklu komórkowego, osiągając największą ekspresję w fazie G2 i M [9].
Stwierdzono również istotny wzrost markerów różnicowania i proliferacji, w tym białka Ki-67, w skórze zdrowych wolontariuszy poddanej ekspozycji na UVB i odnotowano, że nasilenie ekspresji tych białek koreluje pozytywnie z wielkością dawki jednostkowej, ale także z dawką kumulacyjną UVB [10]. Carpenter i wsp. [11], analizując ekspresję antygenu Ki-67 i białka p53 w zmianach o typie rogowacenia słonecznego oraz w skórze uszkodzonej przez UVR, wykazali istotne jej nasilenie w tych dwóch grupach w porównaniu z nienaświetlaną grupą kontrolną.
W badaniu Gambicher i wsp. [12] analizowano wpływ dużych rumieniotwórczych dawek (3 MED) UVB oraz UVA-1 na naskórkową ekspresję białek proliferacyjnych (Ki-67, inwolukryna) oraz adhezyjnych (E-kadheryna oraz koneksyna 43). Wykazano istotnie większą ekspresję antygenu Ki-67 oraz inwolukryny przy jednoczesnym zmniejszeniu ekspresji E-kadheryny w skórze poddanej naświetlaniu UVB w porównaniu ze skórą naświetlaną UVA-1 i skórą nienaświetlaną. Na podstawie przeprowadzonych badań autorzy sugerowali, że ekspozycja na duże dawki UVB istotnie zaburza ekspresję białek zaangażowanych w procesy proliferacji i adhezji komórkowej, pośrednio tłumacząc ich rolę w indukowaniu procesu zapalnego, a także rozwoju i progresji nowotworów skóry.
Podobne obserwacje uzyskano w badaniach własnych, ponieważ we wszystkich naświetlanych grupach stwierdzono istotnie większą liczbę komórek Ki-67(+) niż w grupie kontrolnej, jednak najsilniejszą statystycznie różnicę w ekspresji tego antygenu zaobserwowano w grupie 2. (10 × 0,7 MED + 3 MED UVB). Zwiększonej proliferacji pod wpływem ekspozycji na UVR towarzyszy zwiększona ekspresja COX-2 w komórkach warstwy podstawnej naskórka, która ma zdolność regulacji, aktywacji białka p53 i hamowania procesu apoptozy komórek z uszkodzonym DNA [13]. Obserwacje te wskazują na udział dawki kumulacyjnej UVB w indukowaniu nadmiernej aktywności proliferacyjnej komórki i pośrednio mogą świadczyć o rozwoju zjawisk, które w konsekwencji mogą prowadzić do fotokancerogenezy.
W badaniach własnych za pomocą metod immunohistochemicznych badano również ekspresję b-kateniny, uzyskując istotnie mniejszą liczbę komórek b-kateniny (+) (odczyn błonowy) we wszystkich grupach naświetlanych, co jest zgodne z obserwacjami innych autorów [12].
W badaniach przeprowadzonych w warunkach in vitro na hodowli keratynocytów, HaCaT wykazano, że naświetlania UVB przyczyniają się do proteolitycznego rozszczepienia kompleksu adhezyjnego E-kadheryna/b i g-katenina, co w konsekwencji może prowadzić do zaburzenia integralności skóry [14].
Dotychczas nie badano wpływu UVR na ekspresję tej proteiny w zdrowej skórze. Jedynie Demirkan i wsp. [15] oceniali obecność tego białka, ale w zmianach melanocytowych, zlokalizowanych na skórze przewlekle eksponowanej na UVR. W badaniach tych stwierdzono istotnie mniejszą ekspresję b-kateniny w zmianach eksponowanych przewlekle na UVR w stosunku do wykwitów chorobowych zlokalizowanych na skórze nienarażonej na przewlekłe działanie promieniowania słonecznego.
W badaniach własnych analizowano wpływ UVR na ekspresję tego białka w zdrowej skórze. Obserwowane zależności potwierdzają wyniki uzyskane przez tych autorów [15]. Świadczy to, że aplikowane dawki UVB mają zdolność do zaburzenia procesów adhezji komórkowej oraz dysregulacji szlaków przekazywania sygnałów komórkowych, które są zaangażowane w proces skórnej kancerogenezy.
Uzyskane wyniki oraz obserwacje innych autorów sugerują istotny udział UVB w zaburzeniu procesów proliferacyjnych, a także ich zdolność do uszkodzenia integralności naskórka. Obserwowane zjawiska są prawdopodobnie jednymi z elementów biorących udział w fotokancerogenezie, ale również ze względu na rozluźnienie połączeń międzykomórkowych odgrywają rolę w inwazyjności procesu nowotworowego.
Praca finansowana z funduszy statutowych Uniwer-sytetu Medycznego nr 503-1-1019-1 oraz pracy własnej nr 502-11-725

Piśmiennictwo

1. Drobetsky EA, Turcotte J, Châteauneuf A. A role for ultraviolet A in solar mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92: 2350-4.
2. Garssen J, van Loveren H. Effects of ultraviolet exposure on the immune system. Crit Rev Immunol 2001; 21: 359-97.
3. Norval M, McLoone P, Lesiak A, Narbutt J. The effect of chronic ultraviolet radiation on the human immune system. Photochem Photobiol 2008; 84: 19-28.
4. Klein CL, Wagner M, Kirkpatrick CJ, Van Kooten TG. A new quantitative test method for cell proliferation based on detection of the Ki-67 protein. J Mater Sci Mater Med 2000; 11: 125-32.
5. Edström DW, Porwit A, Ros AM. Effects on human skin of repetitive ultraviolet-A1 (UVA1) irradiation and visible light. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2001; 17: 66-70.
6. Saldanha G, Ghura V, Potter L, Fletcher A. Nuclear beta-catenin in basal cell carcinoma correlates with increased proliferation. Br J Dermatol 2004; 151: 157-64.
7. Fukumaru K, Yoshii N, Kanzaki T, Kanekura T. Immunohistochemical comparison of beta-catenin expression by human normal epidermis and epidermal tumors. J Dermatol 2007; 34: 746-53.
8. Fitzpatrick TB. The validity and practicality of sun-reactive skin types I through VI. Arch Dermatol 1988; 124: 869-71.
9. Sasaki K, Murakami T, Kawasaki M, Takahashi M. The cell cycle associated change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression. J Cell Physiol 1987; 133: 579-84.
10. Lee JH, An HT, Chung JH, et al. Acute effects of UVB radiation on the proliferation and differentiation of keratinocytes. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2002; 18: 253-61.
11. Carpenter PM, Linden KG, McLaren CE, et al. Nuclear morphometry and molecular biomarkers of actinic keratosis, sun-damaged, and nonexposed skin. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13: 1996-2002.
12. Gambichler T, Rotterdam S, Tigges C, et al. Impact of ultraviolet radiation on the expression of marker proteins of gap and adhesion junctions in human epidermis. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2008; 24: 318-21.
13. Tripp CS, Blomme EA, Chinn KS, et al. Epidermal COX-2 induction following ultraviolet irradiation: suggested mechanism for the role of COX-2 inhibition in photoprotection. J Invest Dermatol 2003; 121: 853-61.
14. Hung CF, Chiang HS, Lo HM, et al. E-cadherin and its downstream catenins are proteolytically cleaved in human HaCaT keratinocytes exposed to UVB. Exp Dermatol 2006; 15: 315-21.
15. Demirkan NC, Kesen Z, Akdag B, et al. The effect of the sun on expression of beta-catenin, p16 and cyclin d1 proteins in melanocytic lesions. Clin Exp Dermatol 2007; 32: 733-9.