Original paper
Serum level matrix GLA protein (MGP) in end-stage osteoarthritis

Wstęp
Macierz zewnątrzkomórkowa stanowi 90% masy chrząstki, która w 65–80% jest zbudowana z wody, resztę stanowią: kolagen (10–30%), proteoglikany (5–10%), lipidy i niekolagenowe białka macierzy, w tym enzy- my i białka strukturalne [1]. Rola wielu z nich nie została jednak dotychczas poznana [2]. Białka te pełnią prawdopodobnie istotną funkcję w utrzymaniu homeostazy chrząstki, ustalając i zachowując zależność między chondrocytami oraz wpływając na metabolizm macierzy zewnątrzkomórkowej. Prawdopodobnie regulują procesy tworzenia i degradacji tkanki chrzęstnej i utrzymują między nimi stan równowagi [1, 2]. Inną istotną cząsteczką tej grupy białek jest MGP (matrix Gla protein) – białko małocząsteczkowe o masie 8,5 kDa. Białko MGP zawiera w swojej cząsteczce znaczne ilości kwasu g-karboksyglutaminowego [3], a jego synteza jest zależna od witaminy K [3, 4]. Obecność tego białka stwierdzono w niewapniejącej chrząstce oraz mięśniach gładkich ścian naczyń tętniczych [5–8]. Białko to prawdopodobnie chroni macierz chrząstki przed zwapnieniem oraz reguluje różnicowanie się chondrocytów [9–11], pełni również funkcję inhibitorową wobec białka morfogenetycznego 2 (BMP-2), uważanego za główny czynnik o działaniu osteogennym [6, 12–16]. Tworzenie się ognisk zwapnienia w chrząstce stawowej stanowi jedną ze zmian morfologicznych charakterystycznych dla chondrokalcynozy oraz choroby zwyrodnieniowej stawów [17–21].
Cel pracy
Celem pracy była ocena stężenia białka MGP w surowicy osób chorych na idiopatyczną chorobę zwyrodnieniową stawów w późnej fazie choroby.
Materiał i metody
Grupę badaną stanowiło 12 osób chorych na chorobę zwyrodnieniową stawów biodrowych lub kolanowych, w wieku 66±7 lat, w tym 9 kobiet i 3 mężczyzn. Osoby te były zakwalifikowane do wszczepienia całkowitej endoprotezy stawu z powodu zaawansowanych zmian zwyrodnieniowych. Grupę kontrolną stanowiło 14 osób zdrowych, w wieku 65±6 lat, w tym 7 kobiet i 7 mężczyzn. U tych osób w badaniu ankietowym nie wykazano żadnych dolegliwości ze strony układu kostno-stawowego oraz chorób o podłożu zapalnym. Badania laboratoryjne wykonano w surowicy krwi żylnej pobranej w sposób standardowy do suchych, szklanych probówek zamkniętego systemu próżniowego Vacutainer (Beton Dickinson). Po pobraniu wykrzepioną krew odwirowywano (10 min, 3000 obrotów/ min) w celu uzyskania surowicy. Próbki surowicy przechowywano zamrożone w temperaturze –70°C do czasu wykonania oznaczeń. W badanym materiale oznaczono stężenie białka MGP. Badania laboratoryjne przeprowadzono w jednej serii, metodą immunoenzymatyczną ELISA z zastosowaniem gotowego zestawu testowego Human MGP matrix GLA protein firmy Biomedica. Pomiar absorbancji i przeliczenie stężeń wykonano za pomocą czytnika mikropłytek ELISA Lab Systems Muliscan RC z oprogramowaniem GENESIS. Analizę statystyczną otrzymanych wyników przeprowadzono, wykorzystując test t-Studenta oraz test korelacji Pearsona. W celu oceny przydatności diagnostycznej oznaczania białka MGP wykreślono krzywą ROC i obliczono pole pod krzywą.
Wyniki
Średni wiek chorych w schyłkowym stadium choroby zwyrodnieniowej stawów był porównywalny do średniego wieku osób zdrowych, zakwalifikowanych do grupy kontrolnej. W żadnej z grup nie zaobserwowano znamiennej zależności poziomu MGP w surowicy od wieku osób badanych (grupa badana R=–0,1; grupa kontrolna R=–0,2). Stężenie MGP w surowicy osób chorych na chorobę zwyrodnieniową stawów było znamienne mniejsze niż w surowicy osób zdrowych (ryc. 1.). Średni czas odczuwania bólu przez osoby chore na chorobę zwyrodnieniową wynosił 7,5 roku i wahał się od 3 do 27 lat. Im dłużej pacjenci odczuwali dolegliwości bólowe, tym mniejsze było stężenie MGP w ich surowicy (ryc. 2.). Zaobserwowano słabą ujemną korelację między stężeniem MGP w surowicy a czasem, jaki upłynął od pojawienia się pierwszych dolegliwości bólowych do endoprotezoplastyki chorego stawu (ryc. 3.). Pole pod krzywą ROC wynosiło 0,91, co wskazuje na bardzo dobre własności diagnostyczne oznaczania białka MGP w przypadku późnego stadium choroby zwyrodnieniowej stawów (ryc. 4.).
Dyskusja
Białko MGP, zależne od witaminy K, jest jednym z białek strukturalnych macierzy chrząstki [3, 4]. Jest to proteina wydzielana przez proliferujące chondrocyty i komórki mięśni gładkich ścian naczyń krwionośnych [11, 22]. Funkcja MGP polega prawdopodobnie na ograniczaniu odkładania wapnia w tkankach miękkich oraz w przestrzeni zewnątrzkomórkowej chrząstki [23, 24]. Zauważono, że MGP kumuluje się w tkankach głównie na granicy rejonów uwapnienia i tkanki nieuwapnionej [8]. W dojrzałych chrząstkach MGP lokalizuje się w macierzy okołokomórkowej [25]. Jak zaobserwowali Yagami i wsp. [14] oraz Barone i wsp. [7], MGP nie tylko hamuje odkładanie wapnia w chrząstkach, ale reguluje również dojrzewanie chondrocytów i blokuje kostnienie śródchrzęstne rozwijającego się szkieletu. Niedobór białka MGP podczas proliferacji i wzrostu chondrocytów indukuje ich apoptozę [6]. W przypadku fizjologicznego twardnienia szkieletu mineralizacja tkanek jest procesem prawidłowym [11]. O patologicznej kalcyfikacji tkanek mówi się wówczas, gdy ich uwapnienie staje się przyczyną rozwoju choroby [26]. Na nieprawidłową mineralizację tkanek znaczący wpływ może mieć m.in. długotrwale utrzymujący się umiarkowany proces zapalny [27, 28]. Zachodząca z wiekiem nadmierna mineralizacja chrząstek stawowych stanowi istotną przyczynę rozwoju wielu chorób układu kostno-stawowego, wśród których wymienia się również chorobę zwyrodnieniową stawów [19–21, 29]. Jak wynika z przeprowadzonych badań, małe stężenie MGP w surowicy osób chorych w koń- cowej fazie choroby zwyrodnieniowej w stosunku do obserwowanego u osób zdrowych wydaje się potwierdzać udział niedoboru tego białka w rozwoju i progresji zmian zwyrodnieniowych. Zmniejszone stężenie MGP może być wynikiem ubytku macierzy chrząstki, co może z kolei skutkować jej nadmierną kalcyfikacją. Analiza krzywej ROC sugeruje, że oznaczanie białka MGP w surowicy może być niezwykle użyteczne w laboratoryjnej diagnostyce choroby zwyrodnieniowej stawów. Postępującej degeneracji stawów nieodmiennie towarzyszy ból, który często jest pierwszą oznaką choroby. W niniejszej pracy zaobserwowano, że im więcej czasu upłynęło od pierwszych dolegliwości bólowych związanych z rozwijającymi się zmianami zwyrodnieniowymi, odczuwanych przez pacjentów, do operacji endoprotezoplastyki stawu, tym niższe było stężenie białka MGP w surowicy. Wydaje się więc, że małe stężenie MGP stanowi czynnik niekorzystny, predysponujący do szybszego postępu zmian degeneracyjnych. Nadmiernie zmineralizowana chrząstka traci swoją elastyczność i własności amortyzujące, przez co w niewłaściwy sposób przenosi obciążenia w stawie [1]. Na skutek niewystarczającej sprężystości tkanki chrzęstnej dochodzi również do zaburzeń jej odżywiania, co m.in. skutkuje obumieraniem chondrocytów [1]. U myszy ze szczepów charakteryzujących się niedoborem białka MGP obserwuje się nasiloną mineralizację chrząstki i uwapnienie ścian naczyń krwionośnych [22, 23, 30]. Wśród tych myszy zauważa się dużą śmiertelność młodych osobników z powodu znacznego uwapnienia tkanek miękkich i ścian naczyń tętniczych [31]. Maldonado i wsp. [32] sugerują, iż mutacje w obrębie genów kodujących MGP, skutkujące niedoborem syntezy tego białka, predysponują do odkładania związków wapnia w macierzy chrząstki i ścianach tętnic. Jak wynika z przeprowadzonych w niniejszej pracy badań, małe stężenie MGP w surowicy wydaje się czynnikiem sprzyjającym rozwojowi zmian zwyrodnieniowych w stawach. Podsumowanie Znamienne zmniejszenie stężenia białka MGP w surowicy może stanowić przyczynę kalcyfikacji chrząstki stawowej w przebiegu choroby zwyrodnieniowej stawów. Wydaje się, że pomiar stężenia MGP w surowicy może mieć dużą przydatność w laboratoryjnej diagnostyce choroby zwyrodnieniowej stawów


Piśmiennictwo
1. Hyc A, Osiecka-Iwan A, Jóźwiak J, Moskalewski S. Budowa i niektóre cechy biologiczne chrząstki stawowej. Ortop Traum Reh 2001; 3: 151-162. 2. Neame PJ, Tapp H, Azizan A. Noncollagenous, nonproteoglycan macromolecules of cartilage. Cell Mol Life Sci 1999; 55: 1327-1340. 3. Price PA, Williamson MK. Primary structure of bovine matrix Gla protein, a new vitamin K-dependent bone protein. J Biol Chem 1985; 260: 14971-14975. 4. Cranenburg EC, Schurgers LJ, Vermeer C. Vitamin K: the coagulation vitamin that became omnipotent. Thromb Haemost 2007; 98: 120-125. 5. Boström K. Insights into the mechanism of vascular calcification. Am J Cardiol 2001; 88: 20E-22E. 6. Newman B, Gigout LI, Sudre L, et al. Coordinated expression of matrix GLA protein is required during endochondral ossification for chondrocyte survival. J Cell Biol 2001; 154: 659-666. 7. Barone LM, Owen TA, Tassinari MS, et al. Developmental expression and hormonal regulation of the rat matrix Gla protein (MGP) gene in chondrogenesis and osteogenesis. J Cell Biochem 1991; 46: 351-365. 8. Spronk HM, Soute BA, Schurgers LJ, et al. Matrix Gla protein accumulates at the border of regions of calcification and normal tissue in the media of the arterial vessel wall. Biochem Biophys Res Commun 2001; 289: 485-490. 9. Nakatani S, Mano H, Ryanghyok IM, et al. Excess magnesium inhibits excess calcium-induced matrix-mineralization and production of matrix gla protein (MGP) by ATDC5 cells. Biochem Biophys Res Commun 2006; 348: 1157-1162. 10. Stheneur C, Dumontier MF, Guedes C, et al. Basic fibroblast growth factor as a selective inducer of matrix Gla protein gene expression in proliferative chondrocytes. Biochem J 2003; 369: 63-70. 11. Luo G, Ducy P, McKee MD, et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature 1997; 386: 78-81. 12. Corvol MT. The chondrocyte: from cell aging to osteoarthritis. Joint Bone Spine 2000; 67: 557-560. 13. Hale JE, Fraser JD, Price PA. The identification of matrix GLA protein in cartilage. J Biol Chem 1988; 263: 5820-5824. 14. Yagami K, Suh JY, Enomoto-Iwamoto M, et al. Matrix GLA protein is a developmental regulator of chondrocyte mineralization and, when constitutively expressed, blocks endochondral and intramembranous ossification in the limb. J Cell Biol 1999; 147: 1097-1108. 15. Zebboudj AF, Imura M, Boström K. Matrix GLA protein, a regulatory protein for bone morphogenetic protein-2. J Biol Chem 2002; 277: 4388-4394. 16. Xue W, Wallin R, Olmsted-Davis EA, Borrás T. Matrix GLA protein function in human trabecular meshwork cells: inhibition of BMP2-induced calcification process. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47: 997-1007. 17. Buckwalter JA, Martin J. Choroba zwyrodnieniowa stawów. Clinical Symposia 1995; 47: 1-32. 18. Imhof H, Czerny C, Gahleitner A, et al. Koxarthrose. Hüftgelenk Radiologe 2002; 42: 416-431. 19. Gordon GV, Villanueva T, Schumacher HR, Gohel V. Autopsy study correlating degree of osteoarthritis, synovitis and evidence of articular calcification. J Rheumatol 1984; 11: 681-686. 20. Doyle DV. Tissue calcification and inflammation in osteoarthritis. J Pathol 1982; 136: 199-216. 21. Ali SY. Apatite-type crystal deposition in arthritic cartilage. Scan Electron Microsc 1985; 4: 1555-1566. 22. Schurgers LJ, Teunissen KJ, Knapen MH, et al. Characteristics and performance of an immunosorbent assay for human matrix Gla-protein. Clin Chim Acta 2005; 351: 131-138. 23. Gopalakrishnan R, Suttamanatwong S, Carlson AE, Franceschi RT. Role of matrix Gla protein in parathyroid hormone inhibition of osteoblast mineralization. Cells Tissues Organs 2005; 181: 166-175. 24. Shearer MJ. Role of vitamin K and Gla proteins in the pathophysiology of osteoporosis and vascular calcification. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2000; 3: 433-438. 25. Loeser R, Carlson CS, Tulli H, et al. Articular-cartilage ma- trix gamma-carboxyglutamic acid-containing protein. Characterization and immunolocalization. Biochem J 1992; 282: 1-6. 26. Murshed M, Schinke T, McKee MD, Karsenty G. Extracellular matrix mineralization is regulated locally; different roles of two gla-containing proteins. J Cell Biol 2004; 165: 625-630. 27. Rutsch F, Terkeltaub R. Deficiencies of physiologic calcification inhibitors and low-grade inflammation in arterial calcification: lessons for cartilage calcification. Joint Bone Spine 2005; 72: 110-118. 28. Rutsch F, Terkeltaub R. Parallels between arterial and cartilage calcification: what understanding artery calcification can teach us about chondrocalcinosis. Curr Opin Rheumatol 2003; 15: 302-310. 29. Karpouzas GA, Terkeltaub RA. New developments in the pathogenesis of articular cartilage calcification. Curr Rheumatol Rep 1999; 1: 121-127. 30. Luo G, Ducy P, McKee MD, et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature 1997; 386: 78-81. 31. El-Maadawy S, Kaartinen MT, Schinke T, et al. Cartilage formation and calcification in arteries of mice lacking matrix Gla protein. Connect Tissue Res 2003; 44: 272-278. 32. Maldonado I, Reginato AM, Reginato AJ. Familial calcium crystal diseases: what have we learned? Curr Opin Rheumatol 2001; 13: 225-233.