Tumour necrosis factor, tumour necrosis factor receptor I and II and acute phase response markers in ankylosing spondylitis patients

Wstęp
Zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (ZZSK) to przewlekły, postępujący proces zapalny prowadzący do stopniowego usztywnienia stawów, obejmujący stawy krzyżowo-biodrowe, drobne stawy kręgosłupa, pierścienie włókniste oraz więzadła kręgosłupa. Może w nim dochodzić do zajęcia stawów obwodowych i innych narządów (np. tęczówki). Mimo że przyczyna choroby pozostaje nieznana, zwraca się uwagę na toczące się procesy autoimmunologiczne, czynniki genetyczne, infekcyjne oraz środowiskowe.
Na rozwój zapalenia w ZZSK mają wpływ cytokiny regulujące kolejne etapy odpowiedzi immunologicznej. Należą do nich m.in.: interleukina 1 (IL-1), interleukina 2 (IL-2), interleukina 6 (IL-6), czynnik martwicy nowotworu a (tumor necrosis factor a – TNF-α) oraz interferon γ (IFN-g) [1, 2]. Cytokiny te stymulują komórki efektorowe, takie jak fibroblasty, osteoklasty oraz neutrofile, powodując w konsekwencji niszczenie tkanek. Jednocześnie dochodzi do aktywacji limfocytów B i produkcji immunoglobulin. Interleukina 6 zajmuje szczególne miejsce wśród cytokin. Jest uznawana za cytokinę przekaźnikową, ponieważ indukuje produkcję białek ostrej fazy w wątrobie, co stanowi wykładnik systemowej aktywacji zapalnej. Wykazano, iż stężenie białek ostrej fazy odzwierciedla kliniczną aktywność oraz ciężkość choroby u chorych na ZZSK [3]. Wśród białek ostrej fazy należy wymienić: CRP, fibrynogen, a1-antytrypsynę, kwaśną a1-glikoproteinę (AGP), a1-antychymotrypsynę (ACT), a2-antyplazminę, ceruloplazminę oraz surowiczy amyloid A (SAA).
Nie udało się ustalić złotego standardu mierzącego aktywność choroby [4, 5]. Uważa się, iż w celu oceny aktywności procesu chorobowego powinno się brać pod uwagę zarówno objawy kliniczne (bóle nocne kręgosłupa i/lub sztywność poranną, zapalenia stawów obwodowych oraz objawy pozastawowe), jak i wyniki oznaczeń laboratoryjnych markerów zapalenia. Do markerów laboratoryjnych stosowanych w ocenie aktywności zapalenia w ZZSK należą: OB, białka ostrej fazy, spośród których najczęściej wybierane jest CRP, a także cytokiny, takie jak TNF-α [1, 6–9]. Postać błonowa TNF-α jest wiązana głównie przez receptor TNF RI, a receptor TNF RII wiąże formę rozpuszczalną i błonową. Obecność obu receptorów TNF stwierdzono w materiale biologicznym osób chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) oraz ZZSK i dlatego można sądzić, że pełnią one ważne funkcje w regulacji tych chorób.

Materiał i metody
Badania przeprowadzono w grupie 43 mężczyzn, grupę kontrolną stanowiło 60 zdrowych dobranych losowo ochotników. Średnia wieku chorych wynosiła 48,4 ±12,5 roku, zakres 25–70 lat. Średni czas trwania choroby wynosił 18 ±10,9 roku. Rozpoznanie ZZSK ustalono na podstawie kryteriów nowojorskich [10]. Grupę kontrolną stanowili mężczyźni w wieku 28–62 lat (średnia 45,7 ±9,9 roku).
Krew do badań pobierano na czczo, bez dodatku środków hamujących krzepnięcie, a surowice uzyskane po odwirowaniu przechowywano w temperaturze –70°C. Surowicze stężenia wybranych białek ostrej fazy, tj. CRP, AGP, ACT, oraz transferyny oznaczono metodą immunoelektroforetyczną. Stężenie TNF-α, TNF RI, TNF RII w surowicy oznaczono przy użyciu zestawu Quantikine Human (R&D System, USA). Do porównania średniej arytmetycznej oraz odchylenia standardowego (SD) określonej grupy wyników w grupie badanej i kontrolnej posłużono się testem U Manna-Whitneya. Badanie zależności między poszczególnymi zmiennymi przeprowadzono za pomocą testu korelacji Spearmana, będącego również testem nieparametrycznym. W powyższych testach istotność statystyczna dotyczyła porównywanych zmiennych przy współczynniku p < 0,05.

Wyniki
Aktywność choroby w badanej grupie chorych, mierzona wg indeksu BASDAI, wynosiła średnio 3,6 ±2 (zakres 0,8–8,5) i dodatnio korelowała (r = 0,728, p < 0,05) z aktywnością choroby wg indeksu BASFI 3,7 ±2,1 (zakres 0,5–8,7). Stwierdzono dodatnią zależność między wartościami indeksów BASFI (r = 0,34, p < 0,005) i BASMI (r = 0,39, p < 0,001) a czasem trwania choroby (ryc. 1) oraz dodatnią zależność indeksów BASFI oraz BASMI i wiekiem chorych (odpowiednio: r = 0,32, p < 0,01 i r = 0,40, p < 0,001) (ryc. 2).
Wartości OB były podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,001), średnia wartość wynosiła 34 ±29 mm/godz. Stężenie CRP wynosiło 15,9 mg/l, było znamiennie wyższe (p < 0,001) w porównaniu z grupą kontrolną i wykazywało dodatnią korelację ze stężeniami AGP (r = 0,6899, p < 0,05), ACT (r = 0,7926, p < 0,05) oraz wartościami OB (r = 0,5286, p < 0,05). Stężenia białka AGP w surowicy chorych mieściły się w zakresie 520–2204 mg/l i były znamiennie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,001). Średnie stężenie białka ACT w surowicy chorych było zwiększone w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,001) i wykazywało dodatnią korelację z wartościami AGP badanej grupy chorych (r = 0,7358, p < 0,05) oraz ujemną korelację ze stężeniem transferyny (r = –0,3477, p < 0,05). Stężenie transferyny wynosiło 2182 mg/l i było znamiennie niższe w porównaniu ze stężeniem w grupie kontrolnej (p < 0,001).
Stężenie surowiczego TNF-α wynosiło 1,55 pg/ml i nie odnotowano istotnych różnic w porównaniu z grupą kontrolną. Wykazano natomiast dodatnią korelację między stężeniem TNF-α a stężeniami AGP (r = 0,3545, p < 0,05) oraz OB (r = 0,3154, p < 0,05). Średnie stężenia receptora I dla TNF-α w surowicy chorych wynosiło 1464 pg/ml. Stwierdzono znamiennie większe stężenia TNF RI w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,05). Stężenia receptora typu II dla TNF-α w surowicy chorych mieściły się w zakresie od 500 do 3718 pg/ml i nie znaleziono zależności statystycznie znamiennych między grupą badaną a kontrolną. Stwierdzono natomiast istotną zależność między stężeniami wolnych receptorów TNF RI a TNF RII w badanej grupie chorych (r = 0,4917, p < 0,05). Wyniki wszystkich oznaczanych parametrów przedstawiono w tabeli I.

Omówienie
Według Cowlinga i wsp. u chorych na ZZSK istnieje pozytywna korelacja między stężeniami CRP i wartościami OB a aktywnością choroby [6]. Jednocześnie Spoorenberg [9], Dougados i wsp. [3] wykazali, że wzrost wartości OB i stężenia CRP następuje częściej u chorych z objawami pozastawowymi [3, 7]. W badaniu autorów niniejszej pracy zaobserwowano znamiennie wyższe wyniki OB oraz CRP w porównaniu z grupą kontrolną. W wielu badaniach wykazano korelację wskaźników klinicznych z aktywnością zapalną choroby mierzoną za pomocą stężeń CRP [3, 8, 11]. Niektórzy badacze wskazują również na dodatnią korelację między wartościami indeksu BASDAI a stężeniami CRP i wartościami OB [8]. W pracy autorów nie zauważono takich zależności. Spośród innych białek ostrej fazy dodatnią korelację ze stężeniami IgA u chorych na ZZSK wykazują a1-antytrypsyna, kwaśna a1-glikoproteina oraz haptoglobina [12]. Wyniki pracy autorów wykazały znamiennie wyższe wartości AGP, ACT w porównaniu z grupą kontrolną zdrowych osób oraz dodatnie korelacje między oznaczanymi białkami ostrej fazy.
W piśmiennictwie zwraca się uwagę na istnienie korelacji między wartościami wskaźników BASDAI, BASG-6, BASG-t a aktywnością choroby mierzoną stężeniami CRP. Ponadto wykazano pozytywną korelację między wartościami indeksu BASDAI a wartościami OB oraz BASDAI a stężeniami CRP w grupie pacjentów z zajęciem stawów obwodowych i jej brak u pacjentów z objawami wyłącznie ze strony kręgosłupa [8]. Również Lange i wsp. znaleźli korelacje między wartościami indeksu BASDAI a wartościami OB, stężeniami CRP i SAA [13], natomiast Toussirot i wsp. [2] oraz Dougados i wsp. [3] nie wykazali związku między wartościami BASDAI a stężeniami CRP. Wyniki autorów nie wykazały znamiennej statystycznie zależności między wskaźnikami BASDAI, BASG-6, BASG-t a badanymi białkami ostrej fazy. Wydaje się, że przyczyną powyższych rozbieżności mogą być różne grupy chorych, stosowane leki oraz, prawdopodobnie, dane demograficzne, które nie są uwzględniane w analizach.
W ostatnich latach podkreśla się kluczową rolę TNF i jego receptorów w patogenezie chorób reumatycznych. Dwukierunkowość działania TNF-α (stymuluje układ odpornościowy oraz ma działanie immunosupresyjne) potwierdza obserwacja, że działając bezpośrednio na limfocyty T, TNF-α może powodować apoptozę albo proliferację komórek w badaniach in vitro. Czynnik martwicy nowotworu a jest cytokiną prozapalną o działaniu plejotropowym, wytwarzaną przez różne typy komórek, m.in. makrofagi, leukocyty, komórki śródbłonka, adipocyty, komórki mięśni gładkich, a także kardiomiocyty, i zwiększa wytwarzanie IL-1 oraz IL-6, będąc aktywatorem transkrypcji tych cytokin. U osób chorych na RZS oraz ZZSK stwierdza się zwiększoną ekspresję TNF na komórkach błony maziowej i obecnych w niej makrofagach.
W badaniu autorów średnie stężenie TNF-α było wyższe w badanej grupie chorych, natomiast różnica nie była znamienna statystycznie w porównaniu z grupą kontrolną zdrowych osób. Stone i wsp. [14] stwierdzili słabą korelację między wartościami BASDAI a stężeniami TNF-α (p = 0,09), a inni badacze nie zaobserwowali takich zależności [15]. Bal i wsp. [16] wykazali dodatnią korelację jedynie między BASMI i BASFI a stężeniem sIL-2R i – podobnie jak w badaniach autorów – nie stwierdzili korelacji między wskaźnikami indeksów określających aktywność choroby a stężeniami TNF-α. Z wielu badań wynika, że stężenie rozpuszczalnych receptorów dla TNF w osoczu chorych na RZS jest zwiększone i koreluje z aktywnością choroby [17]. Zauważono także, że rozpuszczalne receptory dla TNF mają zdolność do neutralizacji toksycznego działania TNF i mogą się zachowywać jak inhibitory TNF. Heilig i wsp. przeprowadzili badania dotyczące oceny ekspresji receptorów dla TNF u chorych na RZS oraz ZZSK. Stwierdzili, że jednojądrowe komórki zapalne u chorych na RZS wykazywały ekspresję TNF RII we wszystkich badanych przypadkach, natomiast w ZZSK nie wykazywały takiej ekspresji [18]. Wywnioskowano stąd, że receptory te są wskaźnikami aktywności w RZS i mogą zachowywać się tak jak antagoniści dla TNF [17]. U 6 z 11 chorych na ZZSK komórki te wykazywały natomiast ekspresję TNF RI [18]. W badaniach autorów stwierdzono podwyższone wartości TNF RI w porównaniu z grupą kontrolną.
W przeciwieństwie do prac omawiających rolę receptorów dla TNF w patogenezie RZS, publikacji na temat roli tych receptorów w patogenezie ZZSK jest mało. Wyniki autorów niniejszej pracy nie wykazały zależności statystycznej między receptorami RI i RII dla TNF a BASMI i BASDAI. Wydaje się zatem, że stężenie rozpuszczalnych receptorów u mężczyzn chorych na ZZSK nie wpływa na subiektywną ocenę sprawności funkcjonalnej.

Piśmiennictwo
1. Gratacós J, Collado A, Filella X, et al. Serum cytokines (IL-6, TNF-αlpha, IL-1 beta and IFN-gamma) in ankylosing spondylitis: a close correlation between serum IL-6 and disease activity and severity. Br J Rheumatol 1994; 33: 927-931.
2. Toussirot E, Lafforgue P, Boucraut J, et al. Serum levels of interleukin 1-beta, tumor necrosis factor-alpha, soluble interleukin 2 receptor and soluble CD8 in seronegative spondylarthropathies. Rheumatol Int 1994; 13: 175-180.
3. Dougados M, Gueguen A, Nakache JP, et al. Clinical relevance of C-reactive protein in axial involvement of ankylosing spondylitis. J Rheumatol 1999; 26: 971-974.
4. Ruof J, Stucki G. Validity aspects of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein in ankylosing spondylitis: a literature review. J Rheumatol 1999; 26: 966-970.
5. Spoorenberg A, van Tubergen A, Landewé R, et al. Measuring disease activity in ankylosing spondylitis: patient and physician have different perspectives. Rheumatology (Oxford) 2005; 44: 789-795.
6. Cowling P, Ebringer R, Cawdell D, et al. C-reactive protein, ESR, and klebsiella in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 1980; 39: 45-49.
7. Laurent MR, Panayi G. Acute-phase proteins and serum immunoglobulins in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 1983; 42: 524-528.
8. Spoorenberg A, van der Heijde D, de Klerk E, et al. Relative value of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein in assessment of disease activity in ankylosing spondylitis. J Rheumatol 1999; 26: 980-984.
9. Tutuncu ZN, Bilgie A, Kennedy LG, Calin A. Interleukin-6, acute phase reactants and clinical status in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 1994; 53: 425-426.
10. Moll JM, Wright V. New York clinical criteria for ankylosing spondylitis. A statistical evaluation. Ann Rheum Dis 1973; 32: 354-363.
11. Sheehan NJ, Slavin BM, Donovan MP, et al. Lack of correlation between clinical disease activity and erythrocyte sedimentation rate, acute phase proteins or protease inhibitors in ankylosing spondylitis. Br J Rheumatol 1986; 25: 171-174.
12. Mackiewicz A, Khan MA, Reynolds TL, et al. Serum IgA, acute phase proteins, and glycosylation of alpha 1-acid glycoprotein in ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 1989; 48: 99-103.
13. Lange U, Boss B, Teichmann J, et al. Serum amyloid A – an indicator of inflammation in ankylosing spondylitis. Rheumatol Int 2000; 19: 119-122.
14. Stone MA, Payne U, Pacheco-Tena C, Inman RD, et al. Cytokine correlates of clinical response patterns to infliximab treatment of ankylosing spondylitis. Ann Rheum Dis 2004; 63: 84-87.
15. Vazquez-Del MM, Garcia-Gonzalez A, Mun~oz-Valle JF, et al. Interleukin 1beta (IL-1beta), IL-10, tumor necrosis factor-alpha, and cellular proliferation index in peripheral blood mononuclear cells in patients with ankylosing spondylitis. J Rheumatol 2002; 29: 522-526.
16. Bal A, Unlu E, Bahar G, et al. Comparison of serum IL-1 beta, sIL-2R, IL-6, and TNF-αlpha levels with disease activity parameters in ankylosing spondylitis. Clin Rheumatol 2007; 26: 211-215.
17. Heilig B, Wermann M, Gallati H, et al. Evaluation TNF receptor plasma concentrations in patients with rheumatoid arthritis. Clin Investig 1992; 70: 22-27.
18. Heilig B, Pezzutto A, Lukoschek M, Hunstein W. Expression of TNF receptors in rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis. Z Rheumatol 1993; 52: 383-389.