Detection of HPV by polymerase chain reaction (PCR) in paraffin embedded cervical cancer tissue

Wstęp


Rak szyjki macicy zaliczany jest na świecie do jednej z pięciu najczęstszych przyczyn zgonów kobiet z chorobą nowotworową. Jednym z ważnych czynników w jego rozwoju, a także w rozwoju dysplazji, jest zakażenie wirusem papilloma typu ludzkiego (Human Papillomavirus – HPV) [1, 2]. Ludzki wirus brodawczaka należy do rodziny Papovaviridae. Rodzina ta obejmuje 2 rodzaje Papillomavirus i Polyomavirus [3,4]. Cechą tej rodziny jest obecność podwójnej kolistej nici DNA. Zakażenie wirusem z rodziny Papovaviridae prowadzi do zniszczenia komórki, ale może także dojść do ciągłego zakażenia prowadzącego do transformacji komórek oraz rozwoju procesu nowotworowego. W łagodnych formach nowotworów szyjki macicy DNA wirusa HPV występuje najczęściej w postaci wolnej, niezintegrowanej z genomem komórki, kolistej formy określanej jako episom. Jednak w dużym odsetku raków szyjki DNA wirusa jest zintegrowany z genomem gospodarza.

Komórkami docelowymi dla wirusów HPV są komórki warstw rozrodczych skóry i błon śluzowych. Klinicznym efektem zakażenia są brodawki skóry, błon śluzowych: jamy ustnej, dróg oddechowych, narządów płciowych i układu moczowego [5, 6]. Wśród wirusów infekujących błony śluzowe układu moczowo-płciowego wyodrębniono ok. 40 typów, wykazujących związek z różnego rodzaju zmianami w obrębie narządów płciowych kobiet [7]. W zależności od stopnia zagrożenia rozwojem choroby nowotworowej wyróżniono 3 grupy ryzyka z najczęściej występującymi typami HPV. Pierwsza z nich to grupa niskiego ryzyka onkologicznego. Należą do niej HPV: 6, 11, 42, 43, 44. DNA tych typów wykrywany jest najczęściej w łagodnych zmianach rozrostowych, jak condylomata acuminata. Druga grupa to grupa średniego ryzyka onkologicznego z typami HPV: 31, 33, 35, 39, 51, 52 i 58. Ich obecność związana jest z dysplazjami małego i średniego stopnia. Ostatnią grupą jest grupa wysokiego ryzyka onkologicznego. Zalicza się do niej typy HPV: 16, 18, 45 i 56, określane mianem typów onkogennych. Ich DNA jest najczęściej wykrywany w zaawansowanych zmianach nowotworowych w obrębie szyjki macicy [8, 9].

Wykrywanie HPV stało się możliwe dopiero po wprowadzeniu metod stosowanych w biologii molekularnej a zwłaszcza techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Metoda PCR (ang. polymerase chain reaction) należy w chwili obecnej do technik najczęściej stosowanych w biologii molekularnej. Technika PCR umożliwiła gwałtowny rozwój diagnostyki molekularnej ostatnich 10 lat. Dokonała ona przełomu w diagnostyce klinicznej dlatego, że nie wymaga stosowania radioaktywnych izotopów, a ilość uzyskiwanego DNA jest wystarczająca do bezpośredniej obserwacji i oceny podczas rozdziałów elektroforetycznych. Ważnym atutem metody PCR jest jej czułość, wydajność i specyficzność. Najprostszym zastosowaniem reakcji PCR w diagnostyce medycznej jest wykazanie obecności lub nieobecności specyficznego fragmentu DNA. Wykazanie obecności lub braku produktu PCR znalazło zastosowanie w wykrywaniu delecji powodujących występowanie chorób dziedzicznych, np. dystrofii mięśniowej Duchenne’a lub Beckera, w licznych testach na obecność wirusa HIV, HPV czy Hepatitis B.

W obecnej pracy technika PCR została wykorzystana w celu szybkiego i precyzyjnego określenia obecności lub braku wirusa HPV, zarówno z grupy wysokiego, jak i niskiego ryzyka w utrwalonych w parafinie tkankach raka szyjki macicy.


Materiały i metody


I Pacjentki z rakiem szyjki macicy

Materiał do badań w postaci utrwalonych w parafinie wycinków z guza szyjki macicy został uzyskany od 22 kobiet z rakiem szyjki macicy. Pacjentki mieściły się w przedziale wiekowym od 59 do 82 lat (średnia wieku ± SD 66,43±6,68 lat).


II Izolowanie DNA

Pierwszy etap procedury obejmował izolowanie genomowego kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), który następnie poddawano amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

DNA izolowano ze skrawków parafinowych o grubości 10 mm utrwalonych na szkiełku.

Materiał parafinowy:

- usuwano ze szkiełka i umieszczano w probówce
Eppendorfa,

- wytrząsano 3-krotnie ksylenem, odwirowując za każdym razem 3 min na maksymalnych obrotach (8 000 g),

- uzyskany osad przemywano raz 96% alkoholem etylowym, również odwirowując 3 min,



Z tak uzyskanego materiału izolowano DNA z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Niemcy). Uzyskany DNA wykorzystywano w reakcji łańcuchowej polimerazy.


III Reakcja PCR

Reakcja PCR była przeprowadzona z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu PCR Human Papillomavirus Typing Set (Biokom). W badaniach zostały zastosowane dwie pary 20 nukleotydowych starterów, których sekwencje odpowiadają fragmentom sekwencji genów wirusowych E6 i E7 HPV. Para pU-1M/pU-2R pozwala na amplifikację DNA HPV z grupy wysokiego ryzyka onkologicznego (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 51b, 58), natomiast para pU-31B/pU-2R na amplifikację DNA HPV grupy niskiego ryzyka onkologicznego (HPV 6 i 11). Mieszanina reakcyjna (25 ml) obejmowała: 60 ng DNA, 0.2 mM starterów, 50 mM dNTP (deoksynukleotydotrifosforany), bufor 10 x Taq, 1 U polimerazy Taq (Qiagen, Niemcy). Reakcję prowadzono w termocyklerze (GeneAmp PCR system 2400; Perkin Elmer, Norwalk, USA).

Etapy reakcji PCR były następujące: wstępna denaturacja 94oC – 2 min, właściwe 30 cykli, na które składała się: denaturacja w 94oC – 1 min, hybrydyzacja ze starterami 55oC – 2 min, wydłużanie 72oC – 2 min, końcowe wydłużanie 7 min w 72oC.

Analizę produktu prowadzono w 7% żelu poliakryloamidowym (PAGE) i po ok. 2 godz. elektroforezy (napięcie stosowane 8 V/cm) analizowano po barwieniu bromkiem etydyny.

Wirus HPV wysokiego ryzyka charakteryzował się obecnością w żelu pasma o długości 268 pz; wirus HPV niskiego ryzyka pasmem o długości 228 pz (ryc. 1.).


IV Analiza statystyczna

Żaden z parametrów odnoszących się do materiału nowotworowego nie podlegał rozkładowi normalnemu (test Smirnowa-Kolmogorova) i dlatego dla analizy wyników zastosowano testy nieparametryczne. P< było traktowane jako wynik statystycznie znaczący.


Wyniki


Częstość wirusa HPV wysokiego i niskiego ryzyka u chorych na raka szyjki macicy została przedstawiona w tab. I. 18 z 22 próbek rakowych (82%) charakteryzowało się obecnością DNA wirusa HPV wysokiego ryzyka, natomiast tylko 4 z 22 przypadków (18%) wykazywało obecność DNA wirusa niskiego ryzyka. Obecność DNA wirusa HPV wysokiego ryzyka w komórkach rakowych była statystycznie znacząco wyższa niż DNA wirusa HPV niskiego ryzyka (P <0,05).


Dyskusja


W profilaktyce raka szyjki macicy duże znaczenie ma nie tylko wczesne wykrywanie zmian, ale także określenie czynników, mających najbardziej prawdopodobny związek etiopatogenetyczny z procesem kancerogenezy w obrębie tego narządu. Wykrywając osoby zainfekowane wirusem HPV można określić grupę wysokiego ryzyka onkologicznego, którą można następnie poddać ściślejszej kontroli. Próby oszacowania częstości występowania zakażeń wirusem HPV wśród kobiet z chorobą przebiegającą subklinicznie lub w sposób utajony, przynosi różne wyniki, zależnie od badanej populacji i metody stosowanej w celu wykrycia wirusa. Ludzkie wirusy papilloma nie namnażają się w hodowlach komórkowych, nie opracowano również do tej pory modelu zakażenia zwierząt i namnożenia wirusów. W związku z trudnością uzyskania antygenu wirusowego w hodowlach in vitro nie mogą być stosowane standardowe metody serologiczne. Wykrywanie infekcji HPV stało się więc możliwe dopiero po wprowadzeniu metod stosowanych w biologii molekularnej. Największy odsetek zakażeń rozpoznaje się stosując reakcję PCR, która charakteryzuje się największą czułością z obecnie znanych technik biologii molekularnej. Pozwala ona na wykazanie jednej kopii HPV na 105–106 komórek.

Technika PCR staje się obecnie powszechną techniką diagnostyczną, stosowaną w wielu laboratoriach. W celu standaryzacji stosowanej procedury, opracowywane są odpowiednie sekwencje starterów. Uzyskiwane na tej podstawie wyniki są porównywalne i pozwalają w pewnym stopniu uniknąć fałszywej ich interpretacji.

Oprócz tradycyjnej metody PCR niektóre ośrodki badawcze stosują technikę PCR in situ z udziałem odpowiednio znakowanych nukleotydów. Metoda PCR in situ charakteryzuje się bardzo dużą czułością i pozwala na precyzyjne wykrycie bardzo małej liczby kopii wirusowego DNA (nawet pojedynczej kopii genu wirusowego). Jest to jednak metoda dosyć kosztowna i wymagająca specjalistycznej aparatury [10].

Analizę danego typu wirusa HPV prowadzi się przy zastosowaniu metody PCR-RFLP (PCR-RFLP – restriction fragment length polymorphism – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych). Technika PCR-RFLP polega na amplifikacji określonego fragmentu genu, obejmującego sekwencję polimorficzną, będącą miejscem cięcia restrykcyjnego [11]. Po trawieniu restryktazą otrzymuje się różną liczbę fragmentów restrykcyjnych, o różnej długości, zależnie od wersji allelu. Do określenia typu wirusa stosuje się analizę restrykcyjną z wykorzystaniem czterech endonukleaz restrykcyjnych AvaII, AccI, BglII, RsaI. Analiza produktów amplifikacji odbywa się przy zastosowaniu techniki elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Ilościowe oznaczanie kopii genów wirusa HPV prowadzi się z użyciem analizy densytometrycznej, po uprzednim przetworzeniu żeli poliakryloamidowych na obraz cyfrowy.

W obecnej pracy podjęto próbę wykrywania wirusa HPV w utrwalonych w parafinie tkankach przy zastosowaniu techniki PCR. Reultaty wskazują, że jest to metoda skuteczna, prosta oraz szybka i z powodzeniem może być stosowana w przypadku materiału archiwalnego.

Praca powstała w ramach grantu uzyskanego z Komitetu Badań Naukowych nr 3P05C06823.


Piśmiennictwo


1. Bosch FX, Manos MM, Munoz N. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst, 1995; 87: 796-802.

2. zur Hausen H. Papillomavirus infections – a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta, 1996; 1288: 55-78.

3. Francki RIB, Fauquet CM, Knudson DL., Brown F. Classification and Nomenclature of Viruses. Arch Virol, 1991; 2: 147.

4. Boubenider S, Hiesse C, Marchand S, et al. Post-transplantation polyomavirus infections. J Nephrol 1999; 12: 24-9.

5. Szkoda T M, Litwińska B, Kańtoch M. Ludzkie wirusy papilloma: budowa, patogeneza, diagnostyka. Post Mikrobiol 1995; 1: 187-96.

6. Kańtoch M. Wirusologia lekarska. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1999.

7. Iwasawa A, Nieminen P, Lehtinen M, Paavonen J. Human papillomavirus DNA in uterine cervix squamous cell carcinoma and adenocarcinoma detected by polymerase chain reaction. Cancer 1996; 77: 2275-9.

8. Iwasawa A, Nieminen P, Lehtinen M, Paavonen J. Human papillomavirus in squamous cell carcinoma of the ulva by polymerase chain reaction. Obstet Gynecol 1997; 89: 81-4.

9. Qiu X, Zhao M, Tan Y, et al. The synchronous detection of HPV, H-ras and p53 in cervical carcinoma tissues and distribution of HPV infection between the high incidence area and the common area. Exp Oncol 2002; 24: 194-7.

10. Nuovo GJ, MacConnell P, Forde A. Detection of human papilloma virus DNA in formallin-fixed paraffin embedded tissues in situ hybridyzation after amplification by polymerase chain reaction. Am J Pathol 1991; 139: 847-54.

11. Massimo L. Polymerase chain reaction – based methods for the detection of mutations in oncogenes and tumor supressor genes. Hum Pathol 1994; 25: 564-71.


Adres do korespondencji

Beata Smolarz

Pracownia Biologii Molekularnej

Zakład Patomorfologii Klinicznej

Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki

ul. Rzgowska 281/289

93-338 Łódź