eISSN: 2299-0038
ISSN: 1643-8876
Menopause Review/Przegląd Menopauzalny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Special Issues Editorial board Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors
SCImago Journal & Country Rank


 
3/2011
vol. 10
 
Share:
Share:
more
 
 
Original paper

Diagnostic value of β-N-acetyl-D-glucosaminidase and endoglin as molecular markers in postmenopausal women with urinary bladder neoplasms

Waldemar Różański, Marek Lipiński, Paweł Woźniak, Ewa Forma, Anna Krześlak, Magdalena Bernaciak, Mariusz Blewniewski, Magdalena Bryś

Przegląd Menopauzalny 2011; 3: 197–201
Online publish date: 2011/07/04
Article file
- 05_Rozanski.pdf  [0.21 MB]
Get citation
ENW
EndNote
BIB
JabRef, Mendeley
RIS
Papers, Reference Manager, RefWorks, Zotero
AMA
APA
Chicago
Harvard
MLA
Vancouver
 
 

Wstęp



Nienaciekający błony mięśniowej rak pęcherza moczowego (non-muscle invasive bladder cancer) jest jednym z najczęściej występujących nowotworów układu moczowego i stanowi ok. 70% wszystkich nowotworów pęcherza moczowego [1]. W Polsce jest ósmym pod względem częstości zachorowań nowotworem u kobiet. Zgodnie z danymi opublikowanymi przez Zakład Epidemiologii i Prewencji Nowotworów Centrum Onkologii w Warszawie, złośliwe nowotwory pęcherza moczowego u kobiet diagnozowane są w ok. 98% przypadków po 45. r.ż. W 2008 r. odnotowano w Polsce 1281 przypadków tego nowotworu u kobiet, z czego 1261 u osób w przedziale wieku 45–85 lat. W tym samym czasie zmarły z tego powodu 653 kobiety [2].

Nienaciekający rak pęcherza moczowego może długo nie wywoływać żadnych objawów, dlatego niezwykle istotnym zagadnieniem jest odpowiednio wczesna i właściwa diagnostyka choroby. Obecnie w wielu ośrodkach naukowych trwają badania nad wytypowaniem możliwie najczulszych i najbardziej specyficznych markerów molekularnych, których zmiany na poziomie molekularnym można by oznaczać w materiale pozyskiwanym od pacjentów w sposób nieinwazyjny. Coraz częściej podkreśla się w piśmiennictwie naukowym konieczność wytypowania grupy markerów molekularnych tak dobranych, aby w jak najpełniejszy sposób charakteryzowały one proces nowotworowy toczący się w obrębie dróg moczowych [3].

Modyfikacją białek komórkowych, polegającą na przyłączeniu pojedynczych reszt -N-acetylo-D-

-glukozaminy do reszt seryny lub treoniny wiązaniem O-glikozydowym (O-GlcNAc), jest glikozylacja. Do chwili obecnej zidentyfikowano ok. 200 białek komórkowych, w przypadku których potwierdzono występowanie reszt O-GlcNAc. Wyróżnia się wśród nich białka cytoszkieletu, jądrowych kompleksów porowych, chromatyny, polimerazę RNA klasy II i jej czynniki transkrypcyjne, protoonkogeny, supresory nowotworów, jądrowe receptory hormonów, fosfatazy, kinazy, enzymy zaangażowane w procesy metaboliczne i wiele innych. Przyłączenie reszt O-GlcNAc jest modyfikacją wykazującą cechy predestynujące ją do odgrywania istotnej roli w przekazywaniu sygnału, zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych [4–6].

Enzymem usuwającym reszty O-GlcNAc z białek jądrowych i cytoplazmatycznych jest -N-acetylo-D-glukozaminidaza (MGEA5). Wykazuje ona słabą aktywność hialuronidazy oraz aktywność heksozaminidazy, które związane są z N-końcową częścią enzymu. Sekwencja sklonowanej MGEA5 została zidentyfikowana jako sekwencja odpowiadająca antygenowi 5, ulegającemu ekspresji w komórkach oponiaka (meningioma expressed antigen 5 – MGEA5) i powodującemu odpowiedź immunologiczną u pacjentów. Największą ekspresją tego enzymu charakteryzują się mózg, łożysko i trzustka [6–8].

W sygnalizacji indukowanej przez czynniki z rodziny transformującego czynnika wzrostu betatransforming growth factor beta – TGF) oprócz receptorów TGF typu I i II uczestniczą białka określane jako receptory pomocnicze TGF (accesory receptor/auxiliary receptor). Termin receptor pomocniczy nie jest pojęciem systematycznym, gdyż białka te nie pełnią wszystkich funkcji przypisanych receptorom, natomiast mogą wpływać na aktywność szlaku sygnalizacyjnego TGF. Jednym z takich receptorów jest glikoproteina transbłonowa endoglina (cluster of differentiation 105 – CD105). Jest ona receptorem TGF1 i TGF3. Ulega nadekspresji w śródbłonku naczyń krwionośnych tkanek, w których zachodzi waskularyzacja, a szczególnie w powstających de novo naczyniach krwionośnych nowotworów. Sugeruje się, że endoglina może być rozważana jako użyteczny marker neoangiogenezy w nowotworach [9, 10].

Cel pracy



Celem badań była ocena ekspresji MGEA5 i CD105 na poziomie mRNA metodą real-time reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction – PCR) oraz ocena przydatności diagnostycznej i prognostycznej badanych genów jako markerów transformacji nowotworowej pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Materiał i metody



Materiał do badań stanowiły preparaty moczu pobranego od 30 kobiet ze zdiagnozowanymi nowotworami pęcherza moczowego. Średnia wieku w tej grupie wynosiła 64,77 ±9,12 roku. Charakterystyka kliniczno-

-patologiczna preparatów zamieszczona została w tabeli I.

Materiał kontrolny stanowiły preparaty moczu pobranego od 20 kobiet, u których w badaniu ogólnym moczu ani w wywiadzie nie występował krwinkomocz lub krwiomocz, a w badaniu ultrasonograficznym (USG) nie stwierdzono zmian podejrzanych o rozrost nowotworowy. Złuszczone komórki nabłonkowe izolowano z 50 ml moczu. Bezpośrednio po pobraniu próby mocz przechowywano w temperaturze 4oC do chwili wykonywania oznaczeń, a następnie wirowano przy 2,000 rpm przez 15 min. Otrzymany osad przemywano dwukrotnie zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (pH 7,6) i przechowywano w temperaturze –80oC do dalszych oznaczeń.

Izolowanie RNA i synteza cDNA



Całkowite RNA izolowano przy użyciu odczynnika TRI Reagent (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Czystość otrzymanych preparatów RNA określano metodą spektrofotometryczną poprzez pomiar absorbancji przy długości fali 260 nm i 280 nm. Przyjętym kryterium czystości DNA była wartość A260/A280 mieszcząca się w granicach 1,8–2,0.

Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano przy użyciu zestawu PCR Kit ver. 3.0 (Takara Bio Inc. Japonia) zgodnie z zaleceniami producenta. cDNA przechowywano w temperaturze –20C.

Analiza ilościowa produktu amplifikacji w czasie rzeczywistym – reakcja real-time PCR



Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real-time PCR do oznaczenia liczby kopii mRNA dla genu MGEA5 i endogliny. Użyta mieszanina reakcyjna zawierała: 0,5 µl cDNA, 5 µl TaqMan® Universal PCR MasterMix, 0,5 µl 20 × TaqMan® Gene Expression Assays

i 4 l H2O. Real-time PCR prowadzono w urządzeniu Mastercycler®ep realplex (Eppendorf). Początkowa ilość matrycy wyznaczana była na podstawie parametru Ct (teoretyczny numer cyklu, przy którym wartość fluorescencji jest wyższa niż przyjęta arbitralnie wartość graniczna). Pomiar wartości Ct wykonano w dwóch powtórzeniach, jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). Do badań zastosowano następujące sondy TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA): MGEA5 – Hs00201970_m1; CD105 – Hs00923996m1; GAPDH – Hs00266705g1.

Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu programu komputerowego STATISTICA wersja 9.0 (StatSoft, Poland) i MedCalc wersja 6.14 (MedCalc Software, Belgia). Do oceny rozkładów wykorzystano test Kołmogorowa-Smirnowa i po stwierdzeniu rozkładów odmiennych od normalnych do dalszych obliczeń stosowano testy nieparametryczne – U Manna-Whitneya i Kruskala-Wallisa. Wyliczano także współczynnik skoś-

ności, a ponieważ przybierał on wartości niższe niż 1,5, stosowano do obliczeń średnią arytmetyczną oraz odchylenie standardowe (standard deviation – SD). Za istotną statystycznie przyjęto wartość p < 0,05.

Diagnostyczną wartość progową dla MGEA5 i CD105 wyznaczono na podstawie krzywej ROC (receiver operating characteristic). Dla każdej wartości progowej obliczano czułość i swoistość. W oparciu o obliczone parametry utworzono wykres zależności czułości od wartości (100-swoistość). Wykres ten – krzywa ROC – posłużył do oceny zdolności rozdzielczej testów diagnostycznych. Pole pod krzywą (area under curve) –

ROC-AUC – było sprawdzianem zdolności rozdzielczej testu. Za optymalną wartość graniczną dla MGEA5 uznano wartość 98,3, natomiast dla CD105 – 2,0.

Wyniki



Ekspresję mRNA dla genu MGEA5 stwierdzono w 27/30 (90%) preparatach nowotworowych, natomiast uwzględniając wyznaczoną normę – w 23/30 (76,7%). W grupie kontrolnej ekspresja ta wynosiła odpowiednio 20/20 (100%) i zgodnie z wyznaczoną normą – 6/20 (30%).

Częstość wykrywania ekspresji mRNA dla MGEA5 w zależności od typu nowotworu przedstawiała się następująco: w PUNLMP – u 5/6 (83,3%) pacjentek, w carcinoma urotheliale – u 18/24 (75%). Czułość MGEA5 wynosiła 85,2%, a swoistość – 95,0%. Pole pod krzywą ROC wynosiło 0,92 (ryc. 1.).

Rozkład wartości relatywnych charakteryzujących ekspresję mRNA dla genu MGEA5 w odniesieniu do wartości progowej przedstawia rycina 2.

W przypadku genu dla CD105 ekspresję stwierdzono w 14/30 (46,7%) preparatach nowotworowych i wartość ta była identyczna po uwzględnieniu wartości progowej. W grupie kontrolnej ekspresja ta wynosiła odpowiednio 5/20 (25%), natomiast zgodnie z wyznaczoną normą 0/20 (0%). Częstość wykrywania ekspresji mRNA dla endogliny w zależności od typu nowotworu przedstawiała się następująco: w PUNLMP – u 0/6 (0%) pacjentek, w carcinoma urotheliale – u 14/24 (58,3%). Czułość CD105 wynosiła 100%, a swoistość 80,0%. Pole pod krzywą ROC wynosiło 0,98 (ryc. 3.).

Rozkład wartości relatywnych charakteryzujących ekspresję mRNA dla genu CD105 w odniesieniu do wartości progowej przedstawia rycina 4.

Dyskusja



Choroba nowotworowa cechuje się zwiększeniem tempa proliferacji komórek, a tym samym zwiększeniem stopnia anaplazji. Procesom tym towarzyszy dysfunkcja mechanizmów regulacyjnych oraz naprawczych, odpowiedzialnych za prawidłowy przebieg cyklu komórkowego, metabolizm, różnicowanie, wzrost i odnowę tkanek, jak również tworzenie naczyń krwionośnych [1]. W walce z chorobą nowotworową podstawowe znaczenie ma jej wykrycie w jak najwcześniejszym stadium. W przypadku diagnozowania nowotworów pęcherza moczowego za metody pomocne uważane są zarówno badania podmiotowe, jak i przedmiotowe, natomiast ostateczne rozpoznanie można postawić na podstawie badania cystoskopowego i histopatologicznego [11]. Nieliczne są natomiast informacje o przydatności badania wybranych markerów molekularnych w płynach biologicznych w diagnostyce onkologicznej zmian nowotworowych, w tym nowotworów pęcherza moczowego [3].

Monitorowanie ekspresji genu MGEA5 przy zastosowaniu metody real-time PCR w nowotworach pęcherza moczowego wydaje się obiecujące z uwagi na wysoką czułość (85,2%) i swoistość (95,0%) tego markera molekularnego. Ponadto wyznaczona wartość progowa 98,3 pozwala na precyzyjne oddzielenie od siebie populacji kobiet chorych na nowotwory pęcherza moczowego od grupy kobiet zdrowych.

Gen MGEA5 i kodowane przez niego białko są stosunkowo słabo scharakteryzowane w aspekcie udziału w procesie transformacji nowotworowej. Wiadomo jednak, że nadekspresja MGEA5 powoduje zaburzenia cyklu komórkowego. Mechanizm tych zaburzeń może być różny, ale w przypadku nadekspresji omawianego enzymu dochodzi do zmian w fosforylacji białek, szczególnie pRb, opóźnienia przejścia przez fazę M oraz zakłócenia normalnej ekspresji cyklin. Modyfikacja czynników transkrypcyjnych przez reszty O-GlcNAc może wpływać na ich stabilność, wewnątrzkomórkową lokalizację, aktywność oraz interakcje z innymi białkami kompleksów transkrypcyjnych lub DNA. Uważa się, że zachowanie równowagi pomiędzy O-glikozylacją a fosforylacją ma kluczowe znaczenie dla aktywności czynników transkrypcyjnych i ich zdolności do regulowania ekspresji genów, w tym także tych zaangażowanych w procesy nowotworzenia [6, 12].

Proces angiogenezy jest nierozerwalnie związany z progresją nowotworu, a także z jego przerzutowaniem. Liczba czynników stymulujących ten proces jest dość znaczna, niemniej jednym z częściej rozważanych w aspekcie typowania molekularnych markerów nowotworzenia jest endoglina. Wydaje się, że ma ona istotne znaczenie w takich nowotworach, jak: rak piersi, jajnika, endometrium, prostaty czy pęcherza moczowego [13, 14]. Uzyskane przez nas wyniki wskazują, że oznaczanie ekspresji endogliny na poziomie mRNA może stać się użytecznym wskaźnikiem do diagnozowania złośliwych procesów nowotworowych toczących się w obrębie pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym, gdyż ekspresji tego genu nie obserwuje się u osób zdrowych i tych, u których zdiagnozowano PUNLMP. Na podkreślenie zasługuje także wysoka czułość (100%) i swoistość (80,0%) tego potencjalnego markera.

Wyniki przeprowadzonych przez nas badań wskazują, że określanie ekspresji MGEA5 i CD105 na poziomie mRNA metodą real-time może stać się użytecznym markerem w diagnozowaniu i prognozowaniu nowotworów pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym, dzięki któremu możliwe będzie ograniczenie liczby wykonywanych cystoskopii. Badania te jednak wymagają kontynuowania i przebadania większej liczby chorych kobiet.



Praca wykonana z funduszy pracy własnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 502–19–842.



Piśmiennictwo



 1. Kompier LC, van Tilborg AA, Zwarthoff EC. Bladder cancer: novel molecular characteristics, diagnostic, and therapeutic implications. Urol Oncol 2010; 28: 91-6.

 2. Krajowy Rejestr Nowotworów.

 3. Yutkin V, Nisman B, Pode D. Can urinary biomarkers replace cystoscopic examination in bladder cancer surveillance? Expert Rev Anticancer Ther 2010; 10: 787-90.

 4. Slawson C, Housley MP, Hart GW. O-GlcNAc cycling: how a single sugar post-translational modification is changing the way we think about signaling networks. J Cell Biochem 2006; 97: 71-83.

 5. Kudlow JE. Post-translational modification by O-GlcNAc: another way to change protein function. J Cell Biochem 2006; 98: 1062-75.

 6. Krześlak A. Wpływ modyfikacji białek komórkowych przez O-GlcNAc na proces przekazywania sygnału. Postępy Biochemii 2007; 53: 389-99.

 7. Whelan SA, Hart GW. Proteomic approaches to analyze the dynamic relationships between nucleocytoplasmic protein glycosylation and phosphorylation. Circ Res 2003; 93: 1047-58.

 8. Iyer SP, Hart GW. Dynamic nuclear and cytoplasmic glycosylation: enzymes of O-GlcNAc cycling. Biochemistry 2003; 42: 2493-9.

 9. ten Dijke P, Goumans MJ, Pardali E. Endoglin in angiogenesis and vascular diseases. Angiogenesis 2008; 11: 79-89.

10. El-Gohary YM, Silverman JF, Olson PR, et al. Endoglin (CD105) and vascular endothelial growth factor as prognostic markers in prostatic adenocarcinoma. Am J Clin Pathol 2007; 127: 572-9.

11. Lipiński M. Metody diagnostyczne stosowane w rozpoznawaniu raka pęcherza moczowego. Przegląd Urologiczny 2008; 9: 64-71.

12. Slawson C, Zachara NE, Vosseller K, et al. Perturbations in O-linked beta-N-acetylglucosamine protein modification cause severe defects in mitotic progression and cytokinesis. J Biol Chem 2005; 280: 32944-56.

13. Sadłecki P, Walentowicz-Sadłecka M, Grabiec M. Rola angiogenezy w rozwoju nowotworów. Przegl Menopauz 2010; 1: 28-31.

14. Dallas NA, Samuel S, Xia L, et al. Endoglin (CD105): a marker of tumor vasculature and potential target for therapy. Clin Cancer Res 2008; 14: 1931-7.
Copyright: © 2011 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
FEATURED PRODUCTS
Quick links
© 2019 Termedia Sp. z o.o. All rights reserved.
Developed by Bentus.
PayU - płatności internetowe