eISSN: 1897-4309
ISSN: 1428-2526
Contemporary Oncology/Współczesna Onkologia
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Supplements Addendum Special Issues Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors
SCImago Journal & Country Rank
3/2004
vol. 8
 
Share:
Share:
more
 
 

Effect of cyclophosphamide on tumorogenesis of the IL-6 and Hyper-IL-6 gene modified murine melanoma cells

Andrzej Mackiewicz, Dariusz Iżycki, Katarzyna Baksalary-Iżycka, Katarzyna Gryska, Maria Łaciak, Sergiusz Nawrocki

Współcz Onkol (2004) vol. 8: 3 (124-131)
Online publish date: 2004/04/22
Article file
- Wpływ .pdf  [0.46 MB]
Get citation
ENW
EndNote
BIB
JabRef, Mendeley
RIS
Papers, Reference Manager, RefWorks, Zotero
AMA
APA
Chicago
Harvard
MLA
Vancouver
 
 



Wykaz skrótów używanych w pracy
B-78 – ustalona linia komórek czerniaka mysiego;
CD – (cluster of differentiation) – grupa różnicowania;
CTL – (cytotoxic T-lymphocyte) – cytotoksyczne limfocyty T;
CYC – cyklofosfamid;
DMEM – Dulbeccos Modified Eagle’s Medium;
EGFP – Enhanced Green Fluorescent Protein;
FCS – Fetal Calf Serum;
GMTV – (gene modified tumor vaccine) – genetycznie modyfikowana szczepionka komórkowa;
H6 – Hyper-IL-6;
IL – interleukina;
i.p. – (intraperitoneally) – dootrzewnowo;
MHC – (Major Histocompatibility Complex) – główny układ zgodności tkankowej;
NK – (natural killer) limfocyty NK;
s.c. – (subcutaneously) – podskórnie;
sIL-6R – rozpuszczalny receptor dla IL-6;
TGFβ – (Transforming Growth Factor β) – czynnik transformujący wzrost nowotworu β.

WSTĘP
Pomimo stosowania klasycznych form mono- i politerapii czerniaka złośliwego, obejmujących chirurgiczną cytoredukcję, chemioterapię oraz radioterapię, nie osiągnięto istotnych statystycznie zmian w odsetku uzyskanych remisji i poprawie przeżycia chorych [1]. Opracowanie skutecznej strategii terapeutycznej, prowadzącej do wzmocnienia swoistej odpowiedzi przeciwczerniakowej, jest najbardziej pożądanym celem współczesnej onkologii.
Cyklofosfamid (CYC) jest jednym z najczęściej stosowanych leków w terapii nowotworów. Ma on najszerszy zakres działania przeciwnowotworowego wśród środków alkilujących oraz stosunkowo niską toksyczność. Stosowany jest w terapii białaczek, chłoniaków, raka oskrzeli, płuc, żołądka, sutka, jajnika, jądra. Używany jest również w transplantologii oraz w leczeniu niektórych chorób o podłożu autoimmunologicznym [2–6]. Opisano wiele mechanizmów działania cyklofosfamidu, zarówno w badaniach na modelu zwierzęcym, jak i próbach klinicznych [7–11]. Jednym z najważniejszych jest nasilenie odpowiedzi przeciwnowotworowej poprzez nieswoiste blokowanie subpopulacji supresorowych/regulatorowych limfocytów T (CD4+CD25+) zarówno w modelu in vitro, jak i in vivo [12]. Komórki T CD4+CD25+, poprzez syntezę i uwalnianie interleukiny-4
(IL-4), interleukiny-10 (IL-10) oraz TGF-beta, odpowiedzialne są za powstanie stanu immunosupresji i ucieczkę komórek rakowych spod nadzoru immunologicznego [13]. Aktywność biomodulacyjna cyklofosfamidu znalazła szczególne zastosowanie w kombinowanej terapii czerniaka złośliwego. Zastosowanie cyklofosfamidu w terapii złożonej z genetycznie modyfikowanych genem dla IL-2 komórek linii ustalonej mysiego czerniaka B-16 oraz niewielkimi dawkami IL-1 wydłużyło czas przeżycia zwierząt oraz zredukowało odległe przerzuty czerniaka w płucach [14]. Badacze sugerowali, że wykorzystanie niewielkich dawek CYC przed immunizacją genetycznie modyfikowaną szczepionką przeciwnowotworową (GMTV) doprowadziło do zahamowania aktywności komórek CD4+/CD25+ oraz wzrostu efektywności cytotoksycznej komórek NK i CTL. W klinicznych próbach terapii czerniaka użycie CYC wraz z autologicznymi komórkami czerniakowymi, allogenicznym lizatem komórek czerniaka (Melacine) czy poliwalentnym immunogenem (fragmenty auto- lub allogenicznych błon komórkowych skonjugowane z silikonowymi lub lateksowymi cząsteczkami) wydłużyło czas przeżycia chorych na zaawansowanego czerniaka. Efekt działania CYC w tym modelu polegał raczej na zahamowaniu supresorowej funkcji subpopulacji limfocytów T o fenotypie CD4+/CD25+, a nie na bezpośredniej aktywności przeciwnowotworowej [13].
Stosunkowo nieliczne dane literaturowe dotyczące zastosowania CYC w celu podniesienia efektywności terapii nowotworów wykorzystującej GMTV, potwierdzają jego doświadczalną i kliniczną wartość jako czynnika immunomodulacji przeciwnowotworowej. Jednak mechanizmy jego działania nie są dokładnie poznane.
Wcześniejsze badania, przeprowadzone w Zakładzie Immunologii Nowotworów Akademii Medycznej w Poznaniu wykazały, że immunizowanie myszy genetycznie modyfikowanymi IL-6 i rozpuszczalnym receptorem dla IL-6 (sIL-6R) komórkami linii ustalonej mysiego czerniaka,
B-78 zahamowało wzrost guza, przedłużyło czas przeżycia zwierząt oraz indukowało swoiste, efektorowe mechanizmy obronne [15, manuskrypt]. Ponadto zastosowanie mieszaniny komórek B-78 transdukowanych IL-6 i sIL-R nasiliło przeciwnowotworowy efekt GMTV.
W przedstawionej pracy oceniano wpływ cyklofosfamidu na zahamowanie wzrostu komórek linii ustalonej mysiego czerniaka B-78, modyfikowanych genetycznie genami IL-6 i Hyper-IL-6 (H-6) w modelu in vivo.

MATERIAŁ I METODY
Konstrukcja wektorów
retrowirusowych oraz transdukcja komórek docelowych

Do badań wykorzystano słabo immunogenną ustaloną linię komórek mysiego czerniaka B-78 (podtyp komórek B-16), którą utrzymywano w hodowli jednowarstwowej w pożywce DMEM (GIBCO, Edmonton, Canada), wzbogaconej Glutamax I (GIBCO), 10 proc. v/v FCS GIBCO) w 37oC, 5 proc. CO2 w powietrzu. Docelowe komórki B-78 transdukowano retrowirusowym wektorem dwucistronowym podwójnej kopii niosącym cDNA ludzkiej IL-6 oraz H-6 (otrzymane od prof. Stefana Rose-John), jak opisano wcześniej [16–18]. Wysoka ekspresja swoistego RNA dla IL-6 oraz H-6 została potwierdzona w pozytywnie wyselekcjonowanych komórkach B-78 analizą Northern blot, a obecność syntetyzowanego białka IL-6 i H6 została potwierdzona testem ELISA (Genzyme, Cambridge, MA i R&D, Mineapolis, MN odpowiednio). Transdukowane komórki B-78-H1-IL-6 produkowały 12,4 ng/106 komórek/24 godz. IL-6, a komórki B-78/H6 produkowały 14,1 ng/106 komórek/24 godz. białka fuzyjnego H-6 (wg oceny sIL-6R) (dane nieprzedstawione).
W testach cytotoksyczności nieswoistej zastosowano docelowe dla mysich limfocytów NK komórki YAC-1 (ATCC), genetycznie modyfikowane cDNA, kodującym białko wskaźnikowe EGFP. Konstrukcję dwucistronowego wektora ekspresyjnego pMINV-EGFP, transdukcję komórek docelowych YAC-1 oraz selekcję pozytywnych klonów YAC-1/EGFP wykonano zgodnie z metodą opisaną wcześniej [19]. Wewnątrzcytoplazmatyczną ekspresję EGFP potwierdzono w mikroskopie fluorescencyjnym (Olympus IX70, Japonia).

Hodowla zwierząt
i model doświadczalny

W badaniach wykorzystano 6-tygodniowe myszy chimeryczne C57/BL6xC3H (samice, F1, Instytut Immunologii Doświadczalnej im. Hirszfelda, Wrocław). Hodowlę prowadzono w zwierzętarni Zakładu Toksykologii Akademii Medycznej w Poznaniu. Zwierzęta zostały podskórnie zaszczepione komórkami wyjściowymi (5x105) linii ustalonej mysiego czerniaka B-78 oraz modyfikowanymi genetycznie cDNA kodującym interleukinę-6 (B-78/IL-6) i hybrydowe białko fuzyjne Hyper-IL-6 (B-78/H6). Kontrolną grupę I–III (n=21) stanowiły zwierzęta, którym wstrzyknięto wyjściowe komórki
B-78 (grupa I) lub genetycznie modyfikowane komórki B78/IL-6 (grupa II) i B-78/H6 (grupa III). Zwierzętom kontrolnym dootrzewnowo podano 100 μl PBS. Grupy doświadczalne podzielone zostały na 2 podgrupy IA–IIIA i IB–IIIB. Myszy z grup IA–IIIA (n=21) oraz z grup IB–IIIB (n=21) otrzymały dootrzewnowo cyklofosfamid (CYC) (Astra Medica, Szwajcaria) – 100 mg/kg m.c. i 500 mg/kg m.c., odpowiednio 2 dni przed zaszczepieniem wyjściowych i modyfikowanych genetycznie komórek B78 (tab. 1.). Oceniano średni czas przeżycia zwierząt oraz dynamikę wzrostu guza (ocena co 7 dni od zaszczepienia).

Cytotoksyczność komórek NK
Analiza cytotoksyczności komórek NK wobec docelowych komórek YAC-1 została wykonana w cytometrze przepływowym (EPICS, Coulter) za pomocą metody opisanej wcześniej [19]. Genetycznie modyfikowane EGFP komórki docelowe YAC-1 inkubowano (w obecności jodku propydyny) ze świeżymi limfocytami izolowanymi z krwi obwodowej zwierząt w 28. dniu (wirowanie w gradiencie – Gradisol – Polfa, Kutno) po zaszczepieniu wyjściowymi i genetycznie modyfikowanymi IL-6 i H-6 komórkami B-78. Po 4–6-godzinnej inkubacji (37oC w atmosferze 5 proc. CO2 w powietrzu), dokonano pomiaru cytotoksyczności, w której oceniano następujące populacje komórkowe: 1) YAC-1/GFP, 2) YAC-1/IP, 3) YAC-1/GFP/IP. Z procentowej wartości regionów analitycznych obliczano aktywność cytotoksyczną komórek efektorowych NK za pomocą poniższego wzoru:

B1+B2
———— x 100 = A%, gdzie
100-B3

A – aktywność cytotoksyczna,
B1 – komórki GFP-/PI+ – komórki docelowe YAC-1 z częściowo uszkodzoną błoną komórkową,
B2 – komórki GFP+/PI+ – zniszczone komórki docelowe YAC-1,
B3 – komórki niewyznakowane,
B4 – komórki docelowe YAC-1 nieuszkodzone.

Analizowano co najmniej 10 tys. komórek. Prawidłowe parametry dyskryminatora umożliwiły eliminację fragmentów komórek i zanieczyszczeń.

Cytofluorymetryczna ocena ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych: profile Th1/Th2 i Tc1/Tc2
W celu cytofluorometrycznej oceny profilu subpopulacji limfocytów Th1, Th2 oraz Tc1 i Tc2 wykorzystano metodę opisaną wcześniej [20] z modyfikacjami. W skrócie, świeżo izolowane splenocyty od myszy, immunizowanych GMTV: B-78, B-78/IL-6 i B-78/H6 w kombinacji z cyklofosfamidem oraz grupy kontrolnej (bez cyklofosfamidu) były inkubowane z PMA (50 ng/ml) i jonoforem A23187 (1 ug/ml) w obecności monoenzyny 2 μM przez 4 godz. Po 2-krotnym płukaniu, komórki były znakowane przeciwciałem przeciwko limfocytom CD4+ (FITC) i CD8+ (FITC) przez 30 min, utrwalone buforem CytoFix/CytoPerm, permeabilizowane buforem Perm/Wash i znakowane przeciwciałem przeciwko mysiemu IFN-γ (PE) i IL-4 (PE). Oceniano jednoczesną ekspresję IFN-g w splenocytach CD4+ i CD8+ (subpopulacje Th1 i Tc1 odpowiednio) oraz IL-4 w komórkach CD4+ i CD8+ (subpopulacje Th2 i Tc2 odpowiednio). Analizę cytometryczną wykonano za pomocą cytometru przepływowego EPICS (Coulter), wykorzystując protokół Software II.

WYNIKI
Dynamika wzrostu guza
i średni czas przeżycia zwierząt

Średni czas przeżycia zwierząt zaszczepionych wyjściowymi komórkami B-78 wyniósł 5 tyg. Podanie cyklofosfamidu zwierzętom tej grupy spowodowało wydłużenie średniego czasu przeżycia. Wstrzyknięcie komórek B78/IL6 spowodowało istotne przedłużenie czasu przeżycia (>60 dni, 60 proc. zwierząt). Dostarczenie komórek B78/IL-6 oraz B-78/H6 w kombinacji z CYC (100 mg/kg m.c.) istotnie wydłużyło czas przeżycia myszy (>60 dni, 100 proc. zwierząt; >60 dni, 100 proc. zwierząt, odpowiednio). Zastosowanie CYC w dawce 500 mg/kg m.c. (grupa IB–IIIB) spowodowało gwałtowne skrócenie czasu przeżycia zwierząt do 1–3 tyg., co sugeruje wystąpienie toksycznych skutków ubocznych związanych z użytą dawką CYC (ryc. 1.).
Największą dynamikę wzrostu guza zaobserwowano w grupie zwierząt, którym podano dzikie komórki B78 (dzień 35., >40 cm). Dostarczenie myszom CYC w dawce 100 mg/kg m.c. (grupa IA) nie spowodowało istotnych zmian w zahamowaniu wzrostu guza. Nie oceniano wzrostu guza w grupach IB, IIB i IIIB ze względu na krótki czas przeżycia myszy po zastosowaniu dawki CYC 500 mg/kg m.c. Dynamika wzrostu guza w grupie myszy zaszczepionych komórkami B-78/IL-6 (grupa II) była niższa (dzień 35., <15 cm3) w porównaniu z grupą myszy, którym podano wyjściowe komórki
B-78, a dostarczenie cyklofosfamidu w dawce 100 mg/kg m.c. (grupa IIA) istotnie zmniejszyło dynamikę wzrostu guza (dzień 35., <10 cm3) w porównaniu z grupą II. Objętość guza u myszy zaszczepionych komórkami B-78/H6 była istotnie mniejsza (dzień 35., <20 cm3) w porównaniu z grupą kontrolną (grupa I). Kombinowana terapia
B-78/H6 i CYC (100 mg/kg m.c. grupa IIIA) spowodowała istotne statystycznie zahamowanie dynamiki wzrostu guza (ryc. 2.).

Cytofluorometryczna ocena cytotoksyczności komórek NK
Zastosowanie kombinowanej terapii GMTV z CYC [B78/IL-6 i B78/H6 + 100 mg/kg m.c. (grupy IIA, IIIA odpowiednio) nie miała wpływu na istotność różnic poziomu nieswoistej cytotoksyczności limfocytów NK izolowanych z krwi obwodowej (ryc. 3.). Ze względu na krótki czas przeżycia zwierząt, którym podano wyjściowe i modyfikowane genetycznie komórki B-78 oraz CYC w dawce 500 mg/kg m.c. (Grupy IB, IIB, IIIB) nie oceniano poziomu nieswoistej cytotoksyczności obwodowych komórek NK.
Stosunek limfocytów Th1/Th2 i Tc1/Tc2
W grupach myszy, które zaszczepiono komórkami B-78/IL-6 zaobserwowano podwyższony stosunek subpopulacji limfocytów Th1/Th2 (1,69), natomiast w grupie zwierząt zaszczepionych komórkami B-78/H6 stosunek ten wyniósł 1,44.
Zastosowanie w kombinowanej terapii niskiej dawki CYC 100 mg/kg m.c. z komórkami B-78/IL-6 i B-78/H6 nie wpłynęło istotnie na zmianę stosunku limfocytów Th1/Th2 i Tc1/Tc2 w badanych grupach (tab. 2.). Ze względu na krótki czas przeżycia zwierząt w grupach, którym podano wyjściowe i modyfikowane genetycznie komórki B-78 oraz CYC w dawce 500 mg/kg m.c. (grupy IB, IIB, IIIB) nie oceniano stosunku subpopulacji limfocytów
T: Th1/Th2 oraz Tc1/Tc2.

DYSKUSJA
Zidentyfikowanie i sklonowanie genów kodujących cytokiny immunostymulujące (IL-2, IL-6, IL-7,
IL-12, IFNg), cząsteczki kostymulujące (B7.1, B7.2), cząsteczki adhezyjne, chemokiny, czy antygeny zgodności tkankowej (MHC) umożliwiło stworzenie genetycznie modyfikowanych szczepionek komórkowych (GMTV). Czynniki immunostymulujące kodowane przez transgeny i produkowane przez komórki GMTV nie tylko aktywują na drodze parakrynowej komórki układu immunologicznego, ale dodatkowo zwiększają immunogenność samych komórek GMTV, poprzez modyfikację ich fenotypu (wzrost MHC klasy I i II) [21].
Wcześniejsze doniesienia literaturowe wykazały, że wprowadzenie genu dla IL-6 do komórek nowotworowych różnego pochodzenia hamowało rozwój guza, obniżało jego potencję formowania przerzutów oraz nasilało swoistą aktywację efektorowych komórek cytotoksycznych [22–25]. Transdukcja komórek mysiego włókniakomięsaka genem dla IL-6 znacząco zredukowała wzrost guza poprzez aktywację mechanizmów immunologicznych zależnych od komórek T [26]. W modelu odrzucania mysiego raka płuc Lewisa insercja cDNA dla IL-6 stymulowała długotrwałą odpowiedź immunologiczną, angażującą swoiste klony cytotoksycznych komórek T CD8 oraz komórki NK. Wykazano ponadto, że indukcja odpowiedzi nie zależy od subpopulacji limfocytów T CD4+ [27].
W naszych wcześniejszych doświadczeniach wykazano, że podskórne zaszczepienie myszy genetycznie modyfikowanymi IL-6 słabo immunogennymi komórkami mysiego czerniaka B-78 istotnie wydłużyło czas przeżycia myszy, hamowało rozwój guza oraz indukowało swoistą, efektywną odpowiedź przeciwczerniakową zależną od komórek CD4+. Wykazano również, że efektywność immunoterapii znacząco wzrosła, gdy zwierzęta zaszczepiono mieszaniną komórek B-78/IL-6 i komórek transdukowanych cDNA kodującym sIL-6R. Fluorocytometryczna analiza splenocytów izolowanych ze zwierząt, którym dostarczono kombinację komórek B78-/IL-6+B-78/sIL6-R wykazała podwyższoną ekspresję cytokin wewnątrzkomórkowych charakterystycznych dla subpopulacji komórek Th1 [15, 28, manuskrypt]. Ponadto, dzięki zastosowaniu dwucistronowych wektorów retrowirusowych podwójnej kopii (DCCMV), zawierających sekwencję IRES, uzyskano wysoką i stabilną ekspresję produktów transgenów IL-6 i sIL-6Rn zarówno na poziomie swoistego RNA, jak i funkcjonalnego białka. Warunkowało to efektywną stymulację subpopulacji limfocytów T gospodarza oraz indukcję swoistej i nieswoistej odpowiedzi przeciwczerniakowej [29–31].
W przedstawionej pracy dokonano oceny wpływu cyklofosfamidu na zahamowanie tumorogenności genetycznie modyfikowanych IL-6 i H-6 komórek mysiego czerniaka oraz dynamiki wzrostu guza in vivo. W tym celu zastosowano wyjściowe i genetycznie modyfikowane IL-6 i H-6 komórki linii ustalonej mysiego czerniaka B-78, którymi zaszczepiono myszy w kombinacji z PBS (kontrola) i CYC. Wykorzystanie policistronowego nośnika docelowych genów, wektora DCCMV, zapewniło wysoką i długotrwałą ekspresję transgenów na poziomie swoistego RNA oraz produkowanej interleukiny-6 oraz białka fuzyjnego H-6. H-6 jest heterodimerem, składającym się z IL-6 oraz rozpuszczalnego receptora dla IL-6, połączonych elastycznym łącznikiem polipeptydowym [32]. Wykazano, że białko fuzyjne H-6 jest 10–1 000 razy aktywniejsze niż kompleks pojedynczych białek IL-6 + sIL-6R oraz, że jego okres półtrwania w surowicy jest znacząco dłuższy, ze względu na zahamowanie internalizacji w komórkach docelowych [33]. Dowiedziono również wysoką aktywność proliferacyjną H-6 w stosunku do komórek hematopoetycznych szpiku oraz innych gp 130+ populacji komórkowych [34].
Stosunkowo niewiele wiadomo na temat aktywności przeciwnowotworowej białka hyper-IL-6. Wcześniejsza praca Ozbeka i wsp. wykazała, że chimeryczne białko H-6 może nasilać przeciwczerniakową odpowiedź immunologiczną [35]. Podane podskórnie myszom C57BL/6 genetycznie modyfikowane genem H6 komórki mysiego czerniaka B16 zostały całkowicie odrzucone. Zaszczepienie myszy transgenicznych FVB/BL/6 (stała ekspresja antagonisty dla receptora dla GM-CSF) komórkami B16/H6 doprowadziło tylko do częściowej eliminacji guza oraz zahamowania formowania przerzutów, co sugeruje udział, zależnych od GM-CSF wyspecjalizowanych komórek prezentujących antygen.

Przedstawione w pracy wyniki średniego czasu przeżycia zwierząt wykazały, że zaszczepienie myszy genetycznie modyfikowanymi komórkami B-78/H6 istotnie przedłużyło czas przeżycia w porównaniu z grupą kontrolną (B-78+PBS), a także z myszami, którym dostarczono komórki B-78/IL-6. Zastosowanie niskich dawek cyklofosfamidu w kombinowanej terapii z komórkami
B-78/IL-6 lub B-78/H6 doprowadziło do wydłużenia średniego czasu przeżycia zwierząt >60 dni u 100 proc. zwierząt. Ponadto wstrzyknięcie myszom komórek B-78/IL-6 lub B-78/IL-H6 oraz dostarczenie cyklofosfamidu istotnie zahamowało dynamikę wzrostu czerniaka u badanych zwierząt, w porównaniu z grupami, w których podano GMTV modyfikowane B-78/IL-6 i B-78/H6. W świetle doniesień literaturowych dwa niezależne mechanizmy mogą być zaangażowane w zahamowanie tumorogenności. Pierwszy jest prawdopodobnie oparty na bezpośredniej inhibicji aktywności proliferacycjnej komórek mysiego czerniaka [36, 37], drugi na zablokowaniu przez CYC aktywności subpopulacji limfocytów CD4+/CD25+, którym przypisuje się funkcję immunosupresyjną, promującą wzrost nowotworu [38, 39]. Niewielkie różnice w kinetyce wzrostu guza pomiędzy myszami zaszczepionymi wyjściowymi komórkami
B-78+PBS i B-78+100 mg/kg mc CYC wskazują raczej na udział drugiego z wymienionych mechanizmów.
Liczne badania wskazują na istotne znaczenie profilu uwalnianych cytokin na polaryzację odpowiedzi przeciwczerniakowej, szczególnie w czasie prezentacji antygenu efektorowym komórkom T [40–42]. IL-6 uważana jest za jeden z najważniejszych immunomodulatorów regulujących orientację odpowiedzi immunologicznej poprzez indukcję efektorowych komórek Th1 lub Th2. Dowiedziono, że IL-6 indukowała różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w kierunku komórek efektorowych Th2 oraz silnie hamowała zależną od IL-12 polaryzację odpowiedzi immunologicznej w kierunku Th1 [43, 44]. Rola hyper-IL-6 w polaryzacji odpowiedzi przeciwczerniakowej jest jak dotąd nieznana. W naszych badaniach wykazano, że zaszczepienie zwierząt GMTV-B-78/IL-6 oraz GMTV-B-78/H6 przesunęło profil odpowiedzi przeciwczerniakowej w kierunku efektorowych komórek Th1 (GMTV-B-78/IL-6 – Th1: Th2 – 1,69; GMTV-B-78/H6-Th1: Th2 – 1,44). Z kolei zastosowanie kombinowanej, adoptywnej immunochemioterapii indukowało różnicowanie komórek efektorowych w kierunku limfocytów cytotoksycznych typu I. Analiza ekspresji wewnątrzkomórkowych cytokin w grupie myszy zaszczepionych komórkami B-78/IL-6 oraz B-78/H6 oraz cyklofosfamidem wykazała przesunięcie profilu subpopulacji limfocytów komórek T w kierunku efektorowych komórek cytotoksycznych Tc1 (B-78/IL-6 – Tc1: Tc2 – 1,3; B-78/H6 – 1,25 odpowiednio). Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami Chamoto i wsp. [45], którzy wykazali, że zastosowanie CYC w adoptywnej immunoterapii z użyciem izolowanych subpopulacji limfocytów Th1 nasiliło eradykację komórek chłoniaka A20 poprzez polaryzację odpowiedzi w kierunku komórek efektorowych Th1/Tc1.
Wyniki naszych badań potwierdzają przydatność kombinowanej immunoterapii z cyklofosfamidem w celu obniżenia tumorogenności czerniaka. Dalsze badania powinny wyjaśnić swoiste mechanizmy odpowiedzialne za zahamowanie wzrostu guza w mysim modelu odrzucania czerniaka, a także scharakteryzować swoiste subpopulacje komórkowe, biorące w nich udział. Szczególną uwagę należy poświęcić wpływowi H-6 na proliferację i kierunkowe różnicowanie komórek macierzystych i progenitorowych szpiku w subpopulacje komórkowe mogące mieć kluczowy wpływ na organizację przeciwczerniakowej odpowiedzi immunologicznej.
PIŚMIENNICTWO
1. Nawrocki S, Mackiewicz A. Terapia genowa nowotworów wyzwaniem XXI wieku. Współczesna Onkologia 2000; 4: 190-4.
2. Stepkowski SM. Molecular targets for existing and novel immunosuppressive drugs. Expert Rev Mol Med 2000; 2: 1-23.
3. Young RC, Brady MF, Nieberg RK, et al. Adjuvant treatment for early ovarian cancer: a randomized phase III trial
of intraperitoneal 32P or intravenous cyclophosphamide and cisplatin – a gynecologic oncology group study. J Clin Oncol 2003 Dec 1; 21 (23): 4350-5.
4. Fisher RI, Shah P. Current trends in large cell lymphoma. Leukemia 2003; 17 (10): 1948-60.
5. Notaro R, De Renzo A, De Rosa G, et al. Multiple myeloma cured by conventional chemotherapy: a report and a review. Lymphoma 2002; 43 (4): 907-10.
6. Sandler AB. Chemotherapy for small cell lung cancer. Semin Oncol 2003;
30 (1): 9-25.
7. Rubio MT, Kim YM, Sachs T, et al. Antitumor effect of donor marrow graft rejection induced by recipient leukocyte infusions in mixed chimeras prepared with nonmyeloablative conditioning: critical role for recipient-derived IFN-gamma. Blood 2003; 102 (6): 2300-7.
8. Gold JE, Zachary DT, Osband ME. Adoptive transfer of ex vivo-activated memory T-cell subsets with cyclophosphamide provides effective tumor-specific chemoimmunotherapy of advanced metastatic murine melanoma and carcinoma. Int J Cancer 1995;
61 (4): 580-6.
9. Indrova M, Bubenik J, Mikyskova R,
et al. Chemoimmunotherapy in mice carrying HPV16-associated, MHC class I+ and class I-tumours: Effects
of CBM-4A potentiated with IL-2, IL-12, GM-CSF and genetically modified tumour vaccines. Int J Oncol 2003;
22 (3): 691-5.
10. Bass KK, Mastrangelo MJ. Immunopotentiation with low-dose cyclophosphamide in the active specific immunotherapy of cancer. Cancer Immunol Immunother 1998; 47 (1): 1-12.
11. Zhou H, Sequeira M, Goad ME, et al. Efficacy and mechanisms of action of rmB7.2-Ig as an antitumor agent in combination with Adriamycin and Cytoxan chemotherapy. Clin Immunol 2001; 101 (3): 303-14.
12. Mitchell MS. Immunotherapy as part
of combinations for the treatment
of cancer. Int Immunopharmacol 2003;
3 (8): 1051-9.
13. Mitchell MS. Combinations of anticancer drugs and immunotherapy. Cancer Immunol Immunother 2003 Nov;
52 (11): 686-92.
14. Cao X, Zhang W, Wan T, et al. Enhanced antitumor immune responses of IL-2 gene-modified tumor vaccine by combination with IL-1 and low dose cyclophosphamide. J Exp Clin Cancer Res 1999; 18 (2): 173-9.
15. Mackiewicz A, Wiznerowicz M, Roeb E, et al. Interleukin-6-type cytokines and their receptors for gene therapy of melanoma. Ann N Y Acad Sci 1995; 762: 361-73.
16. Wiznerowicz M, Fong AZ, Hawley RG, Mackiewicz A. Development of a double-copy bicistronic retroviral vector for human gene therapy. Adv Exp Med Biol 1998; 451: 441-7.
17. Wiznerowicz M, Fong AZ, Mackiewicz A, Hawley RG. Double-copy bicistronic retroviral vector platform for gene therapy and tissue engineering: application to melanoma vaccine development. Gene Ther 1997; 4 (10): 1061-8.
18. Gotze KS, Keller U, Rose-John S, Peschel C. gp130-stimulating designer cytokine Hyper-interleukin-6 synergizes with murine stroma for long-term survival of primitive human hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol 2001;
29 (7): 822-32.
19. Izycki D, Gryska K, Grabarczyk P, et al. Flow cytometric cytotoxicity assay with GFP gene modified target cells. Adv Exp Med Biol 2001; 495: 429-34.
20. Immunofluorescent staining of intracellular cytokines for flow cytometric analysis. Technical Protocols, Cytokine Analysis, BD Biosciences, BD Pharmingen, 2000; 1386.
21. Wysocki PJ, Mackiewicz A. Szczepionki czerniakowe. Współczesna Onkologia 2003; 8: 626-9.
22. Bubenik J, Simova J, Zeuthen J, et al. Gene therapy of plasmocytoma: comparison of the therapeutic efficiacy of tumor cells transduced with the interleukin-2, interleukin-4, or interleukin-6 genes. Folia Biol (Praha) 1994;
40: 29-36.
23. Tsuberi B, Naparstek E. Modification
of M1 cells by exogenous introduction
of IL-6 gene: a model for gene therapy
of acute and chronic myeloid leukemia
in mice. Leukemia 1995;
9 Suppl 1: S93-97.
24. Cao X, Wang Q, Ju DW, et al. Efficient inducation of local and systemic antitumor immune response by liposome-mediated intratumoral
co-transfer of interleukin-2 gene and interleukin-6 gene. J Exp Clin Cancer Res 1999; 18: 191-200.
25. Sun WH, Kreisle RA, Phillips AW, Ershler WB. in vivo and in vitro characteristic of interleukin 6-transfected B16 melanoma cells. Cancer Res 1992; 52: 5412-15.
26. Mullen CA, Coale MM, Levy AT, et al. Fibrosarcoma cells transduced with the
IL-6 gene exhibited reduced tumorigenicity, increased immunogenicity, and decreased metastatic potential. Cancer Res 1992; 52: 6020-4.
27. Porgador A, Tzehoval E, Katz A, et al. Interleukin 6 gene transfection into Lewis lung carcinoma tumor cells suppresses the malignant phenotype and confers immunotherapeutic competence against parental metastatic cells. Cancer Res 1992; 52: 3679-86.
28. Mackiewicz A, Wiznerowicz M, Roeb E, et al. Soluble interleukin 6 receptor
is biologically active in vivo. Cytokine 1995; 7: 142-9.
29. Izycki D, Wiznerowicz M, Laciak M, et al. Development of double copy dicistronic retroviral vectors for transfer and expression of glycosyltransferase genes. Adv Exp Med Biol 435: 245-50.
30. Wiznerowicz M, Fong AZ, Mackiewicz A, Hawley RG. Double-copy bicistronic retroviral vector platform for gene therapy and tissue engineering: application to melanoma vaccine development. Gene Ther 1997; 4 (10): 1061-8.
31. Greene AL, Makrigiannis AP, Fitzpatrick L, Hoskin DW. Anti-CD3-activated killer T cells: Interleukin-6 modulates the induction of major histocompatibility complex-unrestricted cytotoxicity and the expression of genes coding for cytotoxic effector molecules. J Interferon Cytokine Res 1997; 17 (12): 727-37.
32. Chebath J, Fischer D, Kumar A, et al. Interleukin-6 receptor-interleukin-6 fusion proteins with enhanced interleukin-6 type pleiotropic activities. Eur Cytokine Netw 1997; 8 (4): 359-65.
33. Peters M, Blinn G, Solem F, et al. in vivo and in vitro activities of the gp130-stimulating designer cytokine Hyper-IL-6. J Immunol 1998; 161 (7): 3575-81.
34. Fischer M, Goldschmitt J, Peschel C, et al. I. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nat Biotechnol 1997;
15 (2): 142-5.
35. Ozbek S, Peters M, Breuhahn K, et al. The designer cytokine hyper-IL-6 mediates growth inhibition and GM-CSF-dependent rejection of B16 melanoma cells. Oncogene 2001; 20 (8): 972-9.
36. Palomares T, Alonso-Varona A, Alvarez A, et al. Interleukin-2 increases intracellular glutathione levels and reverses the growth inhibiting effects of cyclophosphamide on B16 melanoma cells. Clin Exp Metastasis 1997;
15: 329-37.
37. Kuwashima Y. Cytomorphology of murine B16 melanoma in vivo after treatment with cyclophosphamide: evidence of ”oncotic” cell death. Anticancer Res 1996; 16: 2997-3000.
38. Casares N, Arribillaga L, Sarobe P,
et al. CD4+/CD25+ regulatory cells inhibit activation of tumor-primed CD4+ T cells with IFN-gamma-dependent antiangiogenic activity, as well as long-lasting tumor immunity elicited by peptide vaccination. J Immunol 2003; 171 (11): 5931-9.
39. Wei WZ, Morris GP, Kong YC. Anti-tumor immunity and autoimmunity: a balancing act of regulatory T cells. Cancer Immunol Immunother 2004;
53 (2): 73-8.
40. Muraille E, Leo O. Revisiting the Th1/Th2 paradigm. Scand J Immunol 1998; 47: 1-9.
41. Coffman RL, von der Weid T. Multiple pathway for the initiation of T helper 2 (Th2) responses. J Exp Med 1997; 185: 373-5.
42. Tsung K, Meko JB, Peplinski GR, et al. IL-12 induces T helper 1-directed antitumor response. J Immunol 1997; 158: 3359-65.
43. Rincon M, Anguita J, Nakamura T,
et al. Interleukin (IL) -6 directs the differentiation of IL-4-producing CD4+ T cells. J Exp Med 1997; 185: 461-9.
44. La Flamme AC, Pearce EJ. The absence of IL-6 does not affect Th2 cell development in vivo, but does lead to impaired proliferation, IL-2 receptor expression, and B cell responses.
J Immunol 1999; 162: 5829-37.
45. Chamoto K, Kosaka A, Tsuji T, et al. Critical role of the Th1/Tc1 circuit for the generation of tumor-specific CTL during tumor eradication in vivo by Th1-cell therapy. Cancer Sci 2003; 94: 924-8.
ADRES DO KORESPONDENCJI
dr med. Dariusz Iżycki
Zakład Immunologii Nowotworów
i Wielkopolskie Centrum Onkologii
ul. Garbary 15
61-866 Poznań
e-mail: dmizy@immuno.pl












Praca finansowana przez KBN, grant 4 PO 5 B 13714


Copyright: © 2004 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2019 Termedia Sp. z o.o. All rights reserved.
Developed by Bentus.
PayU - płatności internetowe