eISSN: 2299-0038
ISSN: 1643-8876
Menopause Review/Przegląd Menopauzalny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Special Issues Editorial board Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors Ethical standards and procedures

SCImago Journal & Country Rank
 
5/2004
vol. 3
 
Share:
Share:
more
 
 

Hormonal replacement therapy in posmenopausal women and neutrophils selected functions - TNF-α preactivation

Grzegorz Stachowiak
,
Grzegorz Surkont
,
Hanna Romanowicz-Makowska
,
Ireneusz Połać
,
Sławomir Jędrzejczyk
,
Tomasz Pertyński
,
Tomasz Stetkiewicz

Online publish date: 2004/10/22
Article file
- Hormonalna.pdf  [0.21 MB]
Get citation
ENW
EndNote
BIB
JabRef, Mendeley
RIS
Papers, Reference Manager, RefWorks, Zotero
AMA
APA
Chicago
Harvard
MLA
Vancouver
 
 









Wstęp
Neutrofile w organizmie ludzkim pełnią niezwykle istotną rolę we wczesnej odpowiedzi, skierowanej przeciwko organizmom patogennym ze środowiska zewnętrznego, zjawiając się jako pierwsze komórki w miejscu toczącego się procesu zapalnego [1]. Cechuje je krótki czas życia, duża aktywność biologiczna i duża zdolność do migracji. Codziennie ok. 100 mln neutrofili opuszcza krążenie, ulegając apoptozie, a na ich miejsce trafiają nowe komórki [1].
Neutrofile wykazują zdolność do chemotaksji, adherencji, fagocytozy i destrukcji sfagocytowanych mikroorganizmów przy pomocy mechanizmów tlenowych i pozatlenowych oraz do degranulacji i uwalniania ziarnistości wewnątrzkomórkowych i produktów metabolizmu tlenowego komórki. Mogą także produkować cytokiny zapalne [1]. Są jednym z najważniejszych źródeł reaktywnych form tlenu w organizmie [1].
Funkcje neutrofili, takie jak migracja, fagocytoza, degranulacja, wytwarzanie reaktywnych form tlenu podlegają regulacji pod wpływem różnych mediatorów [1]. Jednym z takich mediatorów jest TNF-α. TNF-α – czynnik martwicy guzów (ang. tumor necrosis factor) jest białkiem o masie 17 000 daltonów, w skład którego wchodzi 157 aminokwasów. Nazwa tej cytokiny wywodzi się z badań, prowadzonych przez Carswella [2], który wykrył jej obecność w osoczu zwierząt po podaniu endotoksyny. Uważano początkowo, że jest to czynnik wywołujący martwicę nowotworów, wytwarzany przez komórki jednojądrzaste pod wpływem mediatorów zapalenia lub mitogenów [3]. Z dalszych osiągnięć badawczych dotyczących TNF-α należy wspomnieć o ustaleniu sekwencji aminokwasów wchodzących w jego skład oraz zmapowaniu jego genu w 6. parze chromosomów [4].
TNF-α pełni w organizmie ludzkim rolę mediatora wielu procesów zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych. Cytokina ta spełnia bardzo ważną rolę w reakcjach procesu zapalnego. Jest jednym z najsilniejszych modyfikatorów funkcji neutrofili [1, 5]. Ma zdolność indukcji aktywności cytostatycznej i cytotoksycznej neutrofili w stosunku do komórek nowotworowych [6].
Stwierdzono, że pod bezpośrednim wpływem TNF-α dochodzi do zwiększonej ekspresji receptorów integrynowych neutrofila, nasilenia fagocytozy oraz do niewielkiego wzmocnienia wybuchu oddechowego [7].
Termin priming został wprowadzony w 1984 r. przez Guthrie i wsp. [8] do określenia zjawiska wzrostu generacji wolnych rodników przez stymulowane neutrofile po uprzedniej ich preinkubacji z lipolisacharydami. Ten sam termin został zastosowany w odniesieniu do wzmożonej odpowiedzi neutrofili na stymulatory, obserwowanej po preaktywacji czynnikiem pochodzącym z aktywowanych komórek jednojądrzastych [9]. Czynnik ten został wyizolowany i zidentyfikowany jako TNF-α [3]. Późniejsze badania potwierdziły zdolność TNF-α do preaktywacji neutrofili, tzw. primingu. W wyniku preaktywacji neutrofili przy użyciu tej cytokiny, w odróżnieniu od działania bezpośredniego, dochodziło do wzmożonej ich odpowiedzi na następny bodziec.
Opisano zwiększenie wybuchu tlenowego po inkubacji neutrofili z TNF-α i fMLP [7]. Inne badania potwierdzały, że TNF-α sam nie aktywował wytwarzania reaktywnych form tlenu i nie nasilał agregacji i degranulacji, ale preinkubacja neutrofili z TNF-α nasilała znacznie odpowiedź komórek na stymulatory (np. fMLP). Stwierdzono, że efekt preaktywacji zależał od stężenia TNF-a, czasu preinkubacji i temperatury otoczenia [10]. Wiles [11] opisał znaczne zwiększenie poziomu wybuchu tlenowego indukowanego fMLP, C5a, opsonizowanym zymosanem po preinkubacji neutrofili z TNF-α. Neutrofile preinkubowane z TNF-α, w porównaniu do GM-CSF, G-CSF i IL-8 wykazywały największy poziom wybuchu oddechowego po stymulacji fMLP. Jednocześnie preaktywacja przez TNF-α najbardziej zwiększała intensywność wiązania fMLP ze swoistym receptorem na neutrofilu [12].
TNF-α łączy się na powierzchni komórki z receptorami TNF-R (p55, CD120a i p75, CD120b). Badania Zemana i wsp. [1] dostarczają wielu informacji o roli wyżej wymienionych receptorów. Mechanizm transdukcji sygnału na tej drodze receptorowej jest słabo poznany. Przypuszczalnie dochodzi do wzrostu aktywności oksydazy NAD (P) H oraz poprzez jądrowe czynniki transkrypcyjne NF-KB do zmiany transkrypcji genów szeregu biologicznie ważnych mediatorów wtórnych, m.in. IL-1, 6, 8 oraz czynników: PAF, NGF, TGF-β, LTB4, GM-CSF, G-CSF. Dochodzi także do wzrostu ekspresji receptorów powierzchniowych, takich jak integryny CD11/CD14 [13, 14].
Cel pracy
Ocena wpływu złożonej ciągłej hormonalnej terapii zastępczej u kobiet po menopauzie na preaktywację (priming) TNF-α neutrofili krwi obwodowej.
Metodyka
Badaną grupę stanowiło 46 kobiet w okresie pomenopauzalnym, będących pacjentkami Poradni Kliniki Ginekologii i Chorób Menopauzy ICZMP w Łodzi. Średni wiek w badanej grupie wynosił 54,0±5,1 lat, średni wiek wystąpienia menopauzy 49,1±3,5 lat, a średni czas od wystąpienia menopauzy 5,0±4,1 lat.
Kryteriami wykluczającymi były istnienie przeciwwskazań do hormonalnej terapii zastępczej, ostre lub przewlekłe choroby zapalne, cukrzyca, stosowanie leków o właściwościach antyoksydacyjnych i HTZ w okresie ostatnich 6 mies.
Na wykonywanie badań uzyskano zgodę Komisji Etyki Badań Naukowych przy Akademii Medycznej w Łodzi.
Pacjentki zakwalifikowano do hormonalnej terapii zastępczej. Zastosowano HTZ doustną zawierającą 17beta-estradiol i octan norethisteronu.
Efekt antyoksydacyjny HTZ określano, porównując generację reaktywnych form tlenu przez neutrofile krwi obwodowej pacjentek, ocenianą na podstawie pomiaru chemiluminescencji (CL) w czasie tzw. wybuchu tlenowego tych komórek przed rozpoczęciem hormonalnej terapii zastępczej oraz po 3 i po 6 mies. stosowania tej terapii. Do wywołania wybuchu tlenowego neutrofili zastosowano następujące stymulatory: formylo-metionylo-leucylofenyloalaninę (fMLP), octan mirystynianu forbolu (PMA) i zymosan firmy Sigma-Aldrich. Jako wzmacniacza chemiluminescencji bezpośredniej użyto luminolu (Sigma-Aldrich). Do preaktywacji (primingu) neutrofili używano rekombinowanego ludzkiego TNF-α (5x107 U/mg) (Sigma-Aldrich). Płyn PBS (fizjologiczny roztwór NaCl zbuforowany fosforanami) pochodził z firmy Biomed.
Pomiaru chemiluminescencji dokonywano przy użyciu aparatu LUMINOMETR 1251 (Pharmacia LKB). Badania przeprowadzano w stałej temperaturze 37oC±0,1. Luminometr w ciągu 30 min dokonywał 15 pomiarów. Każdą serię pomiarów wykonywano na 4 próbkach krwi, powtarzając ją 2-krotnie. Na podstawie wyników pomiarów obliczano parametry chemiluminescencji: a) pole powierzchni pod krzywą emisji w funkcji czasu, liczoną w ciągu 30 min, wyrażające całkowitą ilość energii wyemitowaną przez komórki w czasie pomiaru), b) maksimum krzywej emisji. Oceniano chemiluminescencję spontaniczną (BS) i stymulowaną fMLP, PMA i zymosanem neutrofili. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili spoczynkowych zawierały: 20 ml krwi pełnej, 20 ml luminolu, 20 ml PBS (BS), lub 20 ml fMLP (2x10-6 M/ml), lub 20 ml PMA (2x10-8 M/ml) lub 30 (l zymosanu (10 mg/ml), PBS do łącznej objętości 1 000 ml. Próbki, w których oceniano wybuch tlenowy neutrofili preaktywowanych były inkubowane przez 30 min z TNF-a (10 ng/ml) przed dodaniem stymulatorów.

Do oceny istotności zmian wartości parametrów chemiluminescencji w czasie stosowania HTZ zastosowano metody analizy wariancji dla zmiennych zależnych.
Wyniki
Stosunek pól pod krzywymi CL i stosunek pików CL neutrofili preaktywowanych, będące miarą preaktywacji (primingu) również uległy zmniejszeniu po 3 mies. stosowania HTZ w sposób statystycznie istotny dla wszystkich stymulatorów (p<0,0005).
Priming neutrofili niestymulowanych i stymulowanych fMLP, PMA i zymosanem, oceniany na podstawie stosunku całkowitych energii CL neutrofili preaktywowanych i spoczynkowych, zmniejszył się średnio po 3. stosowania HTZ odpowiednio o 13, 30,4, 30,9 i 27,9%, a po 6 mies. średnio o 16, 28,9, 29,9 i 27,4% (p<0,0005).
Dyskusja
Analizując parametry chemiluminescencji zarówno neutrofili spoczynkowych, jak i preaktywowanych możliwa stała się ocena wpływu HTZ na priming neutrofili TNF-α. Wykazano, że już 3-miesięczne stosowanie hormonoterapii zastępczej powoduje zmniejszenie zjawiska primingu neutrofili. Stwierdzona zależność nie znajduje odniesień w piśmiennictwie.
W dostępnej literaturze można znaleźć jedynie prace poświęcone badaniu poziomów TNF-α u kobiet po menopauzie, jak i wpływowi hormonalnej terapii zastępczej na te poziomy.
Brooks-Asplund i wsp. stwierdzili 2-krotny wzrost stężeń TNF-a po zastosowaniu zarówno terapii estrogenowej, jak i estrogenowo-gestagenowej [15].
Podobnie w badaniach Porter i wsp. w grupie 27 kobiet pomenopauzalnych, stosujących HRT estrogenowo-gestagenową, poziomy TNF-α były wyższe niż w grupie kobiet niestosujących tej terapii [16].
Zupełnie przeciwstawne wyniki uzyskali Bernard-Poenaru i wsp., którzy w swoich badaniach odnotowali statystycznie istotny spadek wydzielania TNF-a przez komórki krwi obwodowej po 6 mies. stosowania HTZ [17].
Zmniejszenie produkcji wybranych cytokin pod wpływem 17β-estradiolu, w tym również TNF-α, uzyskano także w badaniach in vitro prowadzonych na hodowlach monocytów [18].
Wspomniane wyżej prace dostarczają sprzecznych wyników odnośnie wytwarzania TNF-α u kobiet w okresie pomenopauzalnym stosujących HRT w porównaniu do kobiet bez tej terapii. O wiele bardziej wartościowe wydają się być badania mające na celu ocenę skutków działania tej cytokiny na wybrane komórki.
Zmniejszony priming neutrofili TNF-α po zastosowaniu hormonalnej terapii zastępczej jest z jednej strony zjawiskiem korzystnym, ponieważ zmniejsza generację reaktywnych form tlenu przez te komórki, które to związki wykazują dobrze znane cytotoksyczne, mutagenne i rakotwórcze właściwości w starzejącym się organizmie.
Z drugiej strony, zmniejszenie primingu neutrofili może powodować upośledzenie reakcji odpornościowych organizmu, a także zahamowanie apoptozy nieprawidłowych, zmutowanych komórek.
Piśmiennictwo
1. Zeman K. The role for tumour necrosis factor-a in the induction of human polypolymorphonuclear neutrophil chemiluminescence. Immunol Lett 1996; 53: 45-50.
2. Carswell EA, Old LJ, Kassel RL, et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1975; 72: 3666-70.
3. Aggarwal BB, Kohr WJ, Haas PE. Human tumour necrosis factor production, purification and characterisation. J Biol Chem 1985; 260: 2345-54.
4. Spies T, Morton CC, Nedospasov. Genes for the tumor necrosis factor a and b are linked to human major histocompatybility complex. Proc Natl Acad Sci USA, 1986; 83: 8699-8708.
5. Smith JA. Neutrophils, host defense, and inflammation: a double-edged sword. J Leukocyte Biol 1994; 56: 672-91.
6. Frei B. Reactive oxygen species and antioxidant vitamins: Mechanism of action. Mer J Med 1994; 97: Supl 3A: S5.
7. Perusia B, Kobayashi M, Rossi ME, et al. Immune interferon enhances functional properties of human granulocytes: role of Fc receptors and effect of lymphotoxin, tumor necrosis factor and granulocyte-macrophage stimulating factor. J Immunol 1987; 138: 765-74.
8. Guthrie LA, McPhail LC, Henson PM, et al. Priming of neutrophils for enhanced release of oxygen metabolites by bacterial lipopolysaccharide: evidence for increased activity of the superoxide-producing enzyme. J Exp Med 1984; 160: 1656-71.
9. Cross AS, Lowell GH, Palmblad JC, et al. Mechanism of priming of human neutrophils by a soluble lymphoblastic cell factor. J Immunol 1985; 135: 2074-9.
10. Ogle JD, Noel JG, Sramkoski RM. Adhesive effect of certain cytokines and other perturbants on human neutrophils. Inflammation 1992; 16: 603-12.
11. Wiles ME, Dykens JA, Wright CD. Human neutrophil (PMN) oxygen radical production and cytoskeleton. Life Sci 1995; 57: 1533-46.
12. Elbim C, Bailly S, Chollet-Martin E, et al. Differential priming effects of proinflammatory cytokines on human neutrophil oxidative burst in response to bacterial N-formyl peptides. Infect. Immun 1994; 62: 2195-201.
13. Buttke TM, Sandstrom PA. Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol Today 1994; vol. 15, No 1: 7-10.
14. Tchórzewski H. Zapalenie – początek czy koniec choroby? Alergia Astma Immunologia 1996; 1: 29-34.
15. Brooks-Asplund EM, Tupper CE, Daun JM, et al. Hormonal modulation of interleukin-6, tumor necrosis factor and associated receptor secretion in postmenopausal women. Cytokine 2002; 19 (4): 193-200.
16. Porter VR, Greendale GA, Schocken M, et al. Immune effects of hormone replacement therapy in post-menopausal women. Exp Gerontol 2001; 36 (2): 311-26.
17. Bernard-Poenaru O, Roux C, Blanque R, et al. Bone-resorbing cytokines from peripheral blood mononuclear cells after hormone replacement therapy: a longitudinal study. Osteoporos Int 2001; 12 (9): 769-76.
18. Rogers A, Eastell R. The effect of 17beta-estradiol on production of cytokines in cultures of peripheral blood. Bone 2001; 29 (1): 30-4.
Adres do korespondencji
Klinika Ginekologii i Chorób Menopauzy
Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki
ul. Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48 42 271 15 07
e-mail: kgcm@interia.pl
Copyright: © 2004 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2021 Termedia Sp. z o.o. All rights reserved.
Developed by Bentus.
PayU - płatności internetowe