Kardiochirurgia dorosłych
Evaluation of the effect of filtered blood cardioplegia on adhesion molecule expression during coronary artery bypass grafting procedures

Pierwsze udokumentowane pomostowanie aortalno-wieńcowe (CABG) zostało przeprowadzone w 1967 r. przez Rene Geronimo Favaloro. Zabieg ten jest uznaną metodą leczenia określonych przypadków choroby naczyń wieńcowych. Na przestrzeni lat wyjaśniono wiele mechanizmów zachodzących w poddawanym rewaskularyzacji w krążeniu pozaustrojowym mięśniu sercowym, polegających na torowaniu metabolizmu beztlenowego, mobilizacji wolnych rodników, co może prowadzić do dysfunkcji serca, polegającej na uszkodzeniu miocytów w trakcie niedokrwienia i reperfuzji. Liczne dane z literatury [1–4] jako największe źródło wolnych rodników wskazują aktywowane PMN. W wyniku chemotaksji docierają one do ogniska niedokrwienia, przylegają i agregują z śródbłonkiem naczyniowym oraz fagocytują nie tylko uszkodzone komórki, ale także miocyty, które mogłyby regenerować. Opisane przyleganie do śródbłonka zależy od udziału L-selektyny znajdującej się na powierzchni PMN [5], a reagującej z E-selektyną i antygenem aLevis (x) ulegającym ekspresji na aktywnych komórkach śródbłonka. W trwałej adhezji biorą udział glikoproteiny z rodziny β₂-integryn, zawierające wspólny łańcuch β (antygen CD 18), oraz jedna z podjednostek α (CD11a, CD11b, CD11c.) Najliczniej na PMN występują CD11b/CD18, oddziałujące z molekułami ICAM-1 śródbłonka, CD11a/CD18 łączą się nie tylko z ICAM-1, ale i ICAM-2, pozostałe odgrywają znikomą rolę w tym procesie. Wspomniane agregaty granulocytarne wywołują leukoembolizacje, co znacznie utrudnia przepływ elementów morfotycznych krwi przez naczynia włosowate obszaru niedokrwienia i reperfuzji i jest podstawą zjawiska no-reflow [6]. Niekorzystne procesy mechaniczne, w których biorą udział PMN, są dodatkowo potęgowane aktywowaniem przez nie procesów biochemicznych, czyli wydzielaniem między innymi wazokonstrukcyjnego leukotrienu LTB4 w obszarze niedokrwienia i dużych ilości wolnych rodników tlenowych (anion podtlenkowy, rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru). Rodniki, utleniając lipidy błon komórkowych (dysfunkcja błony i napływ jonów Ca) oraz kwasy nukleinowe komórki, uszkadzają miocyty. W miarę poznawania tych zjawisk przeprowadzano prace eksperymentalne ograniczające ich niekorzystne efekty, stąd doświadczenia na modelach zwierzęcych z redukcją PMN docierających do obszaru niedokrwienia i reperfuzji przez zastosowanie filtrów leukocytarnych oraz surowic antygranulocytarnych [7], hamowanie procesu przylegania do śródbłonka przez przeciwciała monoklonalne przeciwko molekułom adhezyjnym [8] czy ograniczanie czynności wydzielniczej PMN przez stosowanie np. inhibitora leukotrienu LTB-4. W praktyce kardiochirurgicznej do ogólnie przyjętych sposobów kardioprotekcji należą hipotermia miejscowa i ogólna, ograniczenie okresu niedokrwienia i kardioplegia. Płyny kardioplegiczne, oprócz składu (kardiopleginy krystaliczne i krwiste), różnią się drogą podania (retrograde i antegrade), a także właściwościami, ponieważ krew jako nośnik płynu kardioplegicznego zawiera własne mechanizmy antyoksydacyjne (glutation, peroksydaza), zatem ma zdolność wymiatania wolnych rodników. Dodatkowo daje możliwość aerobowego zatrzymania serca z pokryciem zapotrzebowania energetycznego, a jej wyższe ciśnienie onkotyczne zapobiega obrzękowi śródbłonka w okresie reperfuzji. Prace kliniczne [9, 10] potwierdzają przewagę kardiopleginy krwistej (zawiera 1 objętość kardioleginy krystalicznej i 4 objętości krwi z oksygenatora) nad krystalicznymi w operacjach CABG. Mając na uwadze niekorzystny wpływ aktywowanych PMN na poddawany częściowemu niedokrwieniu mięsień sercowy podczas zabiegu CABG, w realizowanym projekcie badawczym podjęliśmy próbę zastosowania filtrów leukocytarnych w trakcie donacji kardiopleginy krwistej w celu redukcji PMN oraz oceny ekspresji ich powierzchownych antygenów (białek uczestniczących w procesie adhezji do śródbłonka).
Cel
Ocena zmiany ekspresji molekuł adhezyjnych reprezentowanych przez antygeny CD18, CD11b i leu-8 na powierzchni wzorcowych PMN pod wpływem osocza osób poddanych bezpośredniej rewaskularyzacji mięśnia sercowego w krążeniu pozaustrojowym z podaniem kardiopleginy krwistej filtrowanej filtrem PALL-BC1B i niefiltrowanej.
Materiał i metody
Grupa badana – 40 pacjentów (po uzyskaniu zgody indywidualnej i akceptacji Terenowej Komisji Etyki Badań Naukowych przy Akademii Medycznej w Poznaniu) z chorobą wieńcową w postaci choroby 3 naczyń lub zwężeniem pnia LTW, poddanych CABG, w wieku 28–68 lat, średnio 56,2, z frakcją wyrzutową 38–67%. U wszystkich chorych wykonano pełną rewaskularyzację mięśnia sercowego, stosując 2–4 pomostów, średnio 2,9. Czas zakleszczenia aorty wynosił 18–42 min. Czas krążenia pozaustrojowego wynosił 43–78 min. U wszystkich pacjentów wykonano pomostowanie z zastosowaniem LIMA, u 4 pacjentów RIMA, u następnych 4 lewej tętnicy promieniowej. U 20 pacjentów zastosowano donację kardiopleginy krwistej filtrowanej (filtr), u pozostałych kardioplegina nie była filtrowana. Pobierano osocze z aorty, żyły głównej i zatoki wieńcowej przed niedokrwieniem, na początku i 25 min po reperfuzji. U pacjentów, którym podawano filtrowaną kardiopleginę, pobierano próbki z linii przed filtrem i za filtrem w trakcie pierwszego i ostatniego podania kardiopleginy. Ekspresji antygenów CD11b, CD18 i leu-8 na powierzchni PMN dokonywano za pomocą cytometrii przepływowej (cytofluorymetr FACson, Beton-Dickinson). Wyniki przedstawiono jako średni kanał fluorescencji (MCF). Ze względu na brak rozkładu normalnego wyników (stwierdzono w teście Kromogorova-Smirnowa) do oceny statystycznej zastosowano testy nieparametryczne (test Wilcoxona i Friedmana).
Wyniki
Stwierdzono istotny statystycznie wzrost ekspresji CD18 i CD11b pod wpływem badanego osocza uzyskanego podczas kolejnych etapów zabiegu. W przebiegu niedokrwienia i reperfuzji dochodzi do wzrostu ekspresji molekuł adhezyjnych na PMN pod wpływem osocza z krwi tętniczej, a zmniejsza się ekspresja tych antygenów po niedokrwieniu w wyniku inkubacji z osoczem krwi żylnej. Zastosowanie filtrów leukocytarnych przy kardioplegii krwistej, w trakcie jej kolejnych podań, nie ma wpływu na ekspresję molekuł adhezyjnych PMN pod wpływem badanego osocza w porównaniu z osoczem chorych operowanych przy użyciu kardiopleginy niefiltrowanej. Wyniki zastawiono w tabelach I–III.
Dyskusja
W ostatnich latach pojawiło się wiele danych z badań eksperymentalnych, głównie na modelu zwierzęcym, dotyczących skuteczności stosowania filtrów leukocytarnych do poprawy wyników leczenia operowanych z użyciem aparatu do krążenia pozaustrojowego (CPB). CPB stymuluje aktywizację PMN [11, 12] poprzez ich oddziaływanie z urządzeniem do wymiany gazowej, różnice temperatur tkanek chorego i perfuzatu, a także w zależności od rodzaju użytej pompy [13, 14]. Wykazano, że perfuzja obszaru zawału krwią pozbawioną PMN prowadziła do wzrostu przepływu wieńcowego (w porównaniu z obszarem perfundowanym pełną krwią [15]), a przy operacjach siniczych wad serca – do zmniejszenia poziomu wolnych rodników [16]. Zastosowanie filtrów leukocytarnych w celu oczyszczania kardiopleginy krwistej w trakcie rewaskularyzacji mięśnia sercowego z zastosowaniem CPB pozwoliło na redukcję PMN przylegających do śródbłonka naczyń włosowatych (a tym samym zmniejszenie ryzyka zatorowo-zakrzepowego, czasowej niewydolności wielonarządowej i zaburzeń homeostazy), co stwierdzono na podstawie badania histopatologicznego bioptatów mięśnia sercowego [17]. Aktywacja PMN następuje nie tylko pod wpływem oddziaływania z niedokrwionym śródbłonkiem (a konkretnie z wydzielanymi przez te komórki interleukiną-8 i endoteliną-1), ale również pod wpływem szeregu czynników osoczowych, m.in. PAF, NO [18], adenozyny, pochodnych kwasu arachidonowego, w tym wspomnianego LTB-4. W wyniku aktywacji dochodzi do wzrostu ekspresji molekuł adhezyjnych [19, 20], ich rozpuszczalnych form, czy do uwolnienia składowych dopełniacza [22], działających silnie chemotaktycznie i przyczyniających się do progresji obszaru martwicy [23]. W przeprowadzonych badaniach własnych dotyczących pacjentów poddanych CABG stwierdzono wzrost ekspresji wszystkich badanych antygenów (CD18, CD11b i leu-8) pod wpływem osocza krwi tętniczej po niedokrwieniu i po 25 min reperfuzjii. Jest to prawdopodobnie wynikiem systemowego uwalniania PMN, ponieważ filtr stosowano w stopniu koniecznym do uzyskania kardiopleginy krwistej, co stanowiło niewielki procent rzutu minutowego serca. W krwi pobieranej z zatoki wieńcowej również uzyskano istotny statystycznie wzrost ekspresji antygenów po niedokrwieniu i 25 min reperfuzji, a za ten proces odpowiedzialny był niedokrwiony mięsień sercowy [4, 19]. Po 25 min reperfuzji zaobserwowaliśmy spadek ekspresji antygenu leu-8. Prawdopodobnie dochodzi do jej złuszczania [24]. Badając krew żylną, stwierdziliśmy spadek ekspresji CD11b i CD18 pod wpływem osocza pobranego po niedokrwieniu (efekt rozcieńczenia krwi krótko po włączeniu CPB). W kolejnych punktach pomiarowych obserwowaliśmy wzrost ekspresji tych antygenów. Nie wykazaliśmy istotnego statystycznie obniżenia ekspresji badanych antygenów po zastosowania filtrów leukocytarnych, chociaż tendencja taka była widoczna. Eliminacja PMN z kardiopleginy krwistej podawanej w trakcie zabiegu CABG nie zmniejsza uwalniania mediatorów aktywujących te komórki przez niedokrwiony mięsień sercowy, co tłumaczy brak istotnego zmniejszenia ekspresji badanych antygenów w kolejnych donacjach kardiopleginy. Celem pracy nie była jednak ocena kliniczna pacjentów poddanych CABG, zróżnicowanych filtracją kardiopleginy lub jej brakiem. Nie odnotowaliśmy zgonu ani poważnych powikłań. IABP nie było stosowane, a pacjenci byli wypisani w stanie ogólnym dobrym.
Wnioski
W przebiegu niedokrwienia i reperfuzji dochodzi do wzrostu ekspresji molekuł adhezyjnych CD11b, CD18 i leu-8 na PMN pod wpływem osocza uzyskanego z krwi tętniczej. Zmniejsza się ekspresja tych antygenów pod wpływem osocza uzyskanego z krwi żylnej w przebiegu CABG. Zastosowanie filtrów leukocytarnych przy kardioplegii krwistej, w trakcie jej kolejnych podań, nie ma wpływu na ekspresję molekuł adhezyjnych PMN.
Piśmiennictwo
1. Hess ML, Rowe GT, Caplan M, Romson JL, Lucchesi B. Identification of hydrogen peroxide and hydroxyl radicals as mediators of leukocyte – induced myocardial dysfunction. Limitation of infarct size with neutrophil inhibition and depletion. Adv Myocardiol 1985; 5: 159-162. 2. Mc Cort JM. Oxygen – derived radicals: a link between reperfusion injury and inflammation. Fed Proc 1987; 46: 2402-2406. 3. Siminiak T, Ozawa T. Neutrophil mediated myocardial injury. Int J Biochem 1993; 25, 2: 1147-1156. 4. Suzuki I, Ogoshi N, Chiba M, Komatsu T, Moizumi Y. Clinical evaluation of leukocyte-depleting blond cardioplegia filter (BC1B) for elective open-heart surgery. Perfusion 1998; 13: 205-210 5. Kishimoto TK, Warnock RA, Jutila MA, Butcher EC, Lane C, Anderson DC, Smith CW. Antibodies against human neutrophil LECAM-1 (LAM-1/Leu-8/DREG-56 antigen) and endothelial cell ELAM-1 inhibit a cammon CD-18- independent adhesion pathway in vitro. Blood 1991; 78: 805-811. 6. Schmid-Schönbein GW, Sung KLP, Tozeren H, Skalak R, Chien S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys J 1981; 36: 243-256. 7. Romson JL, Hook BG, Kunkel SL, Abrams GD, Schork MA, Lucchesi BR. Reduction of the extent of ischemic myocardial injury by neutrophil depletion in the dog. Circulation 1983; 67, 5: 1016-1023. 8. Ma XL, Weyrich AS, Lefer DJ, Buerke M, Albertine KH, Kishimoto TK, Lefer AM. Monoclonal antibody to L-selectin atenuates neutrophil accumulation and protects ischemic reperfused cat myocardium. Circulation 1993; 88: 649-658. 9. Fremes SE, Christakis GT, Weisel RD, Mickle DA, Madonik MM, Ivanov J, Harding R, Seawright SJ, Houle S, McLaughlin PR, et al. A clinical trial of blood and crystalloid cardioplegia. J Thorac Cardiovasc Surg 1984; 88: 726-741. 10. Loop FD: Crystalloid versus blood cardioplegia. Sem Thorac Cardiovasc Surg 1993; 5: 122-123. 11. Chello M, Mastroroberto P, Marchese AR, Maltese G, Santangelo E, Amantea B. Nitric oxide inhibits neutrophil adhesion during experimental extracorporeal circulation. Anesthesiology 1998; 89, 2: 443-448. 12. Macey MG, McCarthy DA, Trivedi UR, Venn GE, Chambers DJ, Brown KA, et al. neutrophil adhesion molecule expression during cardiopulmonary bypass: a comparative study of roller and centrifugal pumps. Perfusion 1997; 12, 5: 293-301. 13. Chello M, Mastroroberto P, Romano P. Complement and nutrophil activation during cardiopulmonary bypass: a randomized comparison of hypotermic and normothermic circulation. Eur J Cardiothorac Surg 1997; 11, 1: 162-168. 14. Kalawski R., Majewski M., Kaszkowiak E, Wysocki H, Siminiak T. Trancardic release of soluble adhesion molecules during coronary artery bypass grafting, Chest 2003; 123, 5: 1355-1360. 15. van de Watering LM, Hermans J, Houbiers JG, van den Broek PJ, Bouter H, Boer F, Harvey MS, Huysmans HA, Brand A. Beneficial effects of leukocyte depletion of transfused blod on postoperative complications in patients undergoing cardiac surgery. Circulation 1998; 97: 562-568. 16. Webb DP, Altenbern CP, Tritt C, et al. Pulmonary implication of filtering various mediators of morbidity found in salvaged blood. J Extra Corpor Technol 1998; 20: 108-114. 17. Sawa Y, Taniguchi K, Kadoba K, et al. Leukocyte depletion attenuates reperfusion injury in patients with left ventricular hypertrophy. Circulation 1993; 9: 1640-1646. 18. Civelek A, Roth M, Lemke P, Klovekorn WP, Bauer EP. Leukocyte- depleted secondary blood cardioplegia attenuates reperfusion injury after myocardial ischemia. Thorac Cardiovasc Surg 2003; 5, 51: 249-254. 19. Bugajski P, Kalawski R, Baliński M, Wysocki H, Olszewski R, Szczepanik A, Siminiak T. Coronary artery bypass grafting: role of endothelin-1. Thorac Cadiovasc Surg 1999; 47: 144-147. 20. Siminiak T, Egdell RM, Dye JF, et al. Soluble adhesion molecules ICAM-1 and E-selectin release during myocardial infarction and coronary angioplasty. J Mol Cell Cardiol 1995; 27, 6: A252. 21. Kalawski R, Bugajski P, Baliński M, et al. Coronary artery bypass grafting: plasma mediated netrophil superoxide anion production. Kardiol Pol 1999; 7: 35-38. 22. Wysocki H, Poniżyński A, Wierusz-Wysocka B, Brocki Z, Czarnecki R. Cardiopulmonary bypass- induced komplement activation. Evidence for C5a participation. Int J Artif Organs 1982; 5: 305-308. 23. Bennett WR, Yawn DH, Migliore PJ, Young JB, Pratt CM, Raizner AE, Roberts R, Bolli R. Activation of the complement system by recombinant tissue activator. J Am Coll Cardiol 1987; 10: 627-632. 24. Le Deist F, Menasche P, Bel A, Lariviere J, Piwnica A, Bloch G. Patterns of changes in netrophil adhesion molecules during normothermic cardiopulmonary bypass. A clinical study. Eur J Cardiothorac Surg 1996: 10, 4: 279-283.