eISSN: 1897-4309
ISSN: 1428-2526
Contemporary Oncology/Współczesna Onkologia
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Supplements Addendum Special Issues Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors
SCImago Journal & Country Rank
4/2006
vol. 10
 
Share:
Share:
more
 
 

Plasmid expression vector encoding sFLT-1 receptor (psFLT-1) inhibits angiogenesis and L1 tumour growth

Maciej Małecki, Katarzyna Gromek, Małgorzata Przybyszewska, Przemysław Janik

Współczesna Onkologia (2006) vol. 10; 4 (145–151)
Online publish date: 2006/06/05
Article file
- Plazmidowy.pdf  [0.21 MB]
Get citation
ENW
EndNote
BIB
JabRef, Mendeley
RIS
Papers, Reference Manager, RefWorks, Zotero
AMA
APA
Chicago
Harvard
MLA
Vancouver
 
 
Wprowadzenie: angiogeneza i antyangiogenna terapia genowa
Proces powstawania naczyń krwionośnych – angiogeneza – obok nieprzecenionej funkcji fizjologicznej, obserwowanej np. podczas embriogenezy, gojenia ran, cyklu menstruacyjnego, warunkuje przebieg wielu procesów patologicznych, takich jak wzrost nowotworów i powstawanie przerzutów czy chorób o podłożu reumatycznym [1]. Angiogeneza (ryc. 1.) jest krytycznym procesem wpływającym na wzrost nowotworów, np. przyjmuje się, że guzy lite bez sieci powstających naczyń krwionośnych nie są w stanie przekroczyć wielkości kilku mm3 [2]. Proces angiogenezy nowotworów jest wieloetapowy i złożony, jest wypadkową działania czynników pobudzających i hamujących unaczynnienie (tab. 1.). Należy również podkreślić fakt, że angiogenezę warunkują bezpośrednio interakcje między komórkami nowotworowymi a szeroko rozumianym mikrośrodowiskiem okołonowotworowym [2, 3]. Antyangiogenna terapia genowa jest jedną ze strategii terapeutycznych genowej terapii nowotworów. Zakłada się np., że bezpośredni, doguzowy transfer genów kodujących inhibitory angiogenezy zaburza unaczynienie i może ograniczać wzrost nowotworu [4]. Antyangiogenną terapię genową cechuje: uniwersalność – ma wpływ na różnorodne typy nowotworów; brak objawów klasycznej oporności na cytostatyki; brak efektów ubocznych; hamowanie powstawania nowych naczyń krwionośnych; hamowanie funkcji naczyń już istniejących; hamowanie wzrostu nowotworów i tworzenia przerzutów. Przeważająca część terapii antyangiogennej ukierunkowana jest na blokowanie sygnalizacji głównej cytokiny proangiogennej – naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF) [4]. VEGF oddziałuje z komórkami za pomocą receptorów VEGFR-1, VEGFR-2 i VEGFR-3 [5]. Receptory VEGFR-1 i VEGFR-2 posiadają wewnętrzną aktywność kinazy tyrozynowej. Gen VEGFR-1 (FLT-1) koduje nie tylko całą, pełną formę receptora FLT-1, ale również jego rozpuszczalną formę – sFLT-1 (ryc. 2.). sFLT-1 po raz pierwszy opisano i sklonowano u człowieka [6], wkrótce jednak okazało się, iż jego obecność stwierdzono u innych ssaków i kręgowców. Wysoki stopień homologii z ludzkim sFLT-1 (ponad 60 proc.) sugeruje, że sFLT-1 jest molekułą filogenetycznie konserwatywną [7, 8]. sFLT-1 powstaje w wyniku swoistego składania pre-mRNA genu FLT-1. Transkrypt sFLT-1 koduje 6 z 7 N-terminalnych, immunoglobulinopodobnych domen, charakterystycznych dla części zewnątrzkomórkowej receptorów VEGF (ryc. 2.). W mRNA sFLT-1 brak jest natomiast sekwencji kodującej fragment międzybłonowy oraz domenę wewnątrzkomórkową o aktywności kinazy tyrozynowej [6]. sFLT-1 wiąże wszystkie izoformy VEGFA, jest kluczowym regulatorem fizjologicznej i patofizjologicznej angiogenezy [6, 9]. Wykazano, iż wiąże on również inne cytokiny, np. PIGF, VEGFB [9]. Rozpuszczalna forma FLT-1, przez wiązanie naczyniowo-śródbłonkowego czynnika wzrostu i blokowanie natywnych receptorów dla VEGF hamuje powstawanie nowych naczyń krwionośnych, ogranicza wzrost masy nowotworów litych i powstawanie przerzutów [6, 10–16]. sFLT-1 może być również wykorzystany w wielu innych stanach chorobowych determinowanych przez angiogenezę, np. w zapobieganiu wystąpieniu ślepoty pojawiającej się jako powikłanie retinopatii cukrzycowej [17–19]. Wśród mechanizmów oddziaływania sFLT-1 z VEGF i hamowania angiogenezy można wymienić: 1) mechanizm podstawowy, czyli wiązanie sFLT-1 z VEGF poza komórką (np. w naczyniach krwionośnych, jamie otrzewnej); powstaje nieaktywny kompleks; aktywność mitogenna VEGF wobec komórek śródbłonka zostaje zniesiona; 2) sFLT może również wiązać się z natywnymi komórkowymi receptorami FLT-1. Wiążąc się z częścią zewnątrzkomórkową FLT-1 (heterodimer) blokuje autofosforylację receptora i tym samym jego funkcję; 3) sFLT-1 może oddziaływać z formami VEGF związanymi z błoną komórkową (np. VEGF189), utrudniając tym samym interakcje między komórkami śródbłonka i komórkami stromalnymi; 4) sFLT-1 jako białko sekrecyjne może przedostawać się do krążenia ogólnego i wpływać na poziom aktywnego VEGF we krwi [9].
W niniejszej pracy wykorzystano niewirusowy wektor ekspresyjny, kodujący rozpuszczalną formę receptora VEGF (psFLT-1). Celem badań były próby ograniczenia angiogenezy i wzrostu guzów L1 u myszy poprzez zastosowanie genowego preparatu antyangiogennego. Praca dotyczy badań związanych z eksperymentalną terapią nowotworów wykorzystującą metody terapii genowej.
Materiał i metody
Wektor psFLT-1, białko sFLT-1

Procedurę klonowania molekularnego wektora psFLT-1 oraz przebieg otrzymywania białka sFLT-1 z stransfekowanych komórek mysiego mięsaka L1 opisano w poprzednich pracach [20, 21]. Gen sFLT-1 amplifikowano metodą PCR na matrycy cDNA uzyskanego z komórek HUVEC, po czym wklonowano do wektora pSEC (Invitrogen) w miejsca EcoRI i XhoI. Uzyskany konstrukt psFLT-1 klonowano w bakteriach E. coli w obecności ampicyliny i izolowano metodą lizy alkalicznej (Endofree Giga kit, Qiagen). Obecność białka sFLT-1 w mediach hodowlanych znad stransfekowanych komórek L1 oceniano metodą Western blot.
Badania na zwierzętach laboratoryjnych
Do badań wykorzystano myszy Balb/c uzyskane w Zakładzie Genetyki i Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych Centrum Onkologii-Instytutu w Warszawie. Każde badanie, opisane poniżej, wykonano 3-krotnie na grupie 14–21 myszy.
Test skórnej angiogenezy
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe samce myszy Balb/c. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu i golono po obu bokach. Następnie wykonano śródskórne iniekcje wektora angiogennego kodującego VEGF165 (pVEGF) [22] (10 mg DNA/0,1 ml 0,9 proc. NaCl). Do iniekcji kontrolnych wykorzystano pusty wektor pSEC oraz 0,9 proc. roztwór NaCl. Œródskórnie podawano również komórki L1 stransfekowane wektorem pVEGF (5x105). Aby ułatwić wizualizację miejsca wstrzyknięcia, preparaty podbarwiano 0,1-proc. roztworem błękitu trypanu. Po 72 godz. zwierzęta uśpiono preparatem Morbital, a miejsca wstrzyknięcia analizowano pod lupą (32x) – liczono nowe naczynia zgodnie z kryteriami zaproponowanymi przez Sidky’ego i Auerbacha [23].
Test angiogenezy matrigelowej
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c (samce) i komórki mysiego mięsaka L1 oraz L1 stransfekowane wektorem pVEGF [22]. Komórki hodowano w pożywce Eagle’a z dodatkiem 10 proc. bydlęcej surowicy i antybiotyków (ampicylina/streptomycyna) w standardowych warunkach. Komórki zawieszano w 0,9 proc. NaCl i mieszano z matrigelem (Becton Dickinson) 1:1. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu, po czym wykonywano podskórne iniekcje mieszaniny matrigelowo-komórkowej do myszy (2 podania, po 6x105 komórek w 0,25 ml mieszaniny). Po 8 dniach myszy usypiano preparatem Morbital, wypreparowywano matrigele, które następnie ważono i rozpuszczano w odczynniku Drabkina (Sigma). Próby inkubowano w 4oC przez 24 godz., okazjonalnie worteksując, odwirowano (5 min, 10 000 rpm, w 4ºC), a następnie mierzono absorbancję przy 540 nm wobec próby odczynnikowej. Z wykonanej wcześniej krzywej kalibracyjnej odczytano zawartość hemoglobiny w badanych próbach. Zawartość hemoglobiny podano w przeliczono na 1 g masy matrigelowej [g/g].
Iniekcja dootrzewnowa komórek nowotworowych
W badaniach wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c obu płci. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu, a następnie wykonano dootrzewnową (ip) iniekcję komórek nowotworowych linii L1 lub badanych transfektantów zawieszonych w 0,9-proc. roztworze NaCl w ilości 1-5x105. Wielkość powstającego wysięku oznaczano średnio co 3 dni, ważąc ciała zwierząt. Określano średni czas przeżycia zwierząt poddanych badaniom.

Iniekcja podskórna komórek nowotworowych
Do badań wykorzystano 6–8-tygodniowe myszy Balb/c obu płci. Zwierzęta usypiano 3,6-proc. roztworem wodzianu chloralu, a następnie wykonano podskórną iniekcję 1-3x105/mysz komórek nietransfekowanych L1 zawieszonych w 0,9-proc. roztworze NaCl lub komórek L1 stransfekowanych badanymi preparatami genowymi. W części badań, po osiągnięciu przez guz L1 wymiaru 1–3 mm średnicy, zwierzęta otrzymywały doguzowo preparat antyangiogenny psFLT-1 3 razy w tyg. (30 mg pDNA/0,1 ml 0,9 proc. NaCl). Wpływ wektora na wzrost nowotworu oceniano średnio co 3 dni, mierząc wielkość guza za pomocą suwmiarki. Objętość guzów określano według zależności: objętość guza [mm3] = (wymiar mniejszy)2 x (wymiar większy) x 0,52.
Statystyczna analiza wyników
Wyniki badań opracowano statystycznie poprzez wyliczenie wartości średnich oraz odchyleń standardowych. Oceny wpływu psFLT-1 na badane procesy dokonano za pomocą analizy wariancji ANOVA, testu Cochran-Coxa oraz t-Studenta dla zmiennych niezależnych. Wartość p<0,01 przyjmowano za znamienną statystycznie. Analizy wpływu preparatów na przeżycie zwierząt dokonano metodą Kaplana-Meiera. Do obliczeń wykorzystano program Statistika 5,0.
Wyniki
W badaniach wykorzystano sklonowany wcześniej [20] wektor ekspresyjny kodujący rozpuszczalną formę receptora VEGF – sFLT-1. Schematyczną mapę wektora przedstawiono na ryc. 3. Konstrukt psFLT-1 jest plazmidowym, niewirusowym wektorem, eksprymującym gen sFLT-1 pod transkrypcyjną kontrolą promotora cmv. Białko sFLT-1 jest efektywnie wydzielane poza transfekowane komórki dzięki obecności immunoglobulinowej sekwencji sekrecyjnej Igk poprzedzającej w kasecie ekspresyjnej gen sFLT-1 (ryc. 3.).
Wpływ psFLT-1 na proces angiogenezy in vivo
Tabela 2. oraz ryc. 4. i 5. przedstawiają wyniki badań oceniających wpływ konstruktu psFLT-1 na proces angiogenezy in vivo. Badania wskazują, że wektor psFLT-1 hamuje angiogenezę indukowaną przez naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (transfekcje pVEGF165) zarówno w teście angiogenezy skórnej, jak i matrigelowej. Badania wykazały, że sFLT-1 wywiera efekt systemowy – po domięśniowym wprowadzeniu wektora psFLT-1 obserwowano zahamowanie angiogenezy skórnej i matrigelowej.


Wpływ wektora psFLT-1 na wzrost guzów
nowotworowych L1

W pracy wykonano wiele badań oceniających wpływ wektora psFLT-1 na wzrost guzów L1 (podskórnych i otrzewnowych) i czas przeżycia zwierząt. Do badań wykorzystano zarówno preparat psFLT-1, jak i komórki L1 stransfekowane psFLT-1, wydzielające białko sFLT-1, co potwierdzono we wcześniejszych pracach [20, 21]. Wyniki doświadczeń przedstawiono na ryc. 6.–10. Badania wskazują, że guzy wywodzące się ze stransfekowanych psFLT-1 komórek L1 charakteryzują się, znamiennie statystycznie, ograniczonym wzrostem w porównaniu z nietransfekowanymi komórkami L1 (ryc. 6.). Konstrukt antyangiogenny psFLT-1, podany zwierzętom domięśniowo (ryc. 7.–8.), również efektywnie wydłuża czas przeżycia zwierząt dootrzewnowo zaszczepionych komórkami L1. Podawanie medium hodowlanego bogatego w białko sFLT-1 również ogranicza ip wzrost L1 i wydłuża czas życia zwierząt. Wyniki doświadczeń na zwierzętach potwierdzają wcześniejsze obserwacje [21] wskazujące, że sFLT-1 jest swoistym inhibitorem angiogenezy indukowanej przez VEGF. Zaszczepianie zwierząt, np. mieszaniną komórek (1:1) stransfekowanych wektorem proangiogennym pVEGF i antyangiogennym psFLT-1 (ryc. 10.) znamiennie statystycznie wydłuża czas przeżycia zwierząt, zaś wektor pVEGF podany myszom śródskórnie nie indukuje angiogenezy, jeśli myszy wcześniej zaszczepiono domięśniowo (tab. 2.) lub również śródskórnie wektorem psFLT-1.
Dyskusja
Białko sFLT-1 jest fizjologicznym, negatywnym regulatorem procesów angiogennych [6–9]. Wykazano, że pełni ono funkcję regulacyjną w czasie tworzenia naczyń krwionośnych w okresie embrionalnym. W czasie ciąży szczególnie trofoblast silnie eksprymuje sFLT-1 wpływając na funkcje biologiczne VEGF (angiogeneza, przepuszczalność naczyń) [7]. Schemat domenowej budowy sFLT-1 przedstawia ryc. 2. Badania wskazują, że w wiązaniu VEGF biorą udział przede wszystkim dwie pierwsze pętle immunoglobulinopodobne nr 1 i 2 [9], choć wiadomo również, iż domena nr 3 warunkuje wysokie powinowactwo receptora do ligandów, zaś domena nr 4 jest niezbędna do dimeryzacji receptora [9]. Wykazano, że oddziaływania między VEGF a pierwszymi domenami sFLT-1 mają charakter hydrofobowy, przy czym wskazuje się, że powinowactwo rekombinowanych form sFLT-1 do VEGF jest znacznie wyższe niż form VEGFR-2. Klonowanie wektorów kodujących formy receptora FLT-1, różne niż trzydomenowa postać natywnego receptora FLT-1, ma na celu konstruowanie skutecznych narzędzi do prób terapii genowej, np. chorób nowotworowych [6, 9]. Badania eksperymentalne, jak również pierwsze próby kliniczne antyangiogennej terapii genowej, wykorzystujące konstrukty genowe psFLT-1 wskazują, że kodowane białka poprzez hamowanie angiogenezy ograniczają wzrost guzów nowotworowych [10–16, 20]. Jak pokazują ryc. 4. i 5. oraz tab. 2. sFLT-1 blokuje proces angiogenezy. W przedstawionych badaniach do indukcji angiogenezy wykorzystano konstrukt kodujący jedną z najsilniejszych cytokin proangiogennych – naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF). Wykazano, że sFLT-1 znosi proangiogenną sygnalizację VEGF. Uzyskane wyniki są zgodne z wcześniej opublikowanymi obserwacjami, opisującymi, że w warunkach in vitro sFLT-1 utrudnia migrację komórek nowotworowych L1 stransfekowanych genem VEGF pozostając bez wpływu na zachowanie komórek stransfekowanych np. genem fibroblastycznego czynnika wzrostu (FGF-2) [21]. Wydłużenie czasu życia i niezauważalna ilość wysięku u zwierząt z nadekspresją sFLT w porównaniu z grupą zwierząt L1 i L1/pVEGF (ryc. 7.–10.) wskazują, że obecny w płynie wysiękowym VEGF może być skutecznie blokowany przez białko sFLT. Hasumi i wsp. [11] wykazali, że sFLT hamuje rozrost raka jajnika i tworzenie wysięku. Badacze, wykorzystując komórki raka jajnika transfekowane wcześniej genem Salt, wykazali, że np. objętość wysięku, liczba komórek nowotworowych, były zdecydowanie niższe w tej grupie niż w grupie kontrolnej. Hoshida i wsp. [15] oraz Takayama i wsp. [16] dowodzą, że sFLT może również hamować rozwój guzów litych. W niniejszej pracy (ryc. 6.) wykazano, że transfektanty L1/psFLT rozwijają u zwierząt guzy nowotworowe zdecydowanie wolniej niż komórki nietransfekowane. Wcześniej również wykazano, że guzy L1 poddane bezpośrednim iniekcjom psFLT-1 wzrastają wolniej niż kontrolne [20], choć efekt terapeutyczny był mniej znamienny niż w przypadku guzów wywodzących się z hodowlanych transfektantów L1/psFLT. Takie obserwacje nie są jednak zaskoczeniem, bowiem powszechnie wiadomo, że skuteczność terapii genowej determinowana jest przede wszystkim, jak dotychczas, przez wydajny transfer genów i ich efektywną ekspresję. System stransfekowanych komórek nowotworowych ma charakter przede wszystkim eksperymentalny – dostarcza ważnych informacji, czy preparat genowy wywołuje efekt biologiczny i w jakim stopniu efekt ten jest zależny od stopnia transfekcji komórek. W aspekcie wykorzystania niewirusowych wektorów antyangiogennych w klinice, niezbędna jest staranna selekcja pacjentów, którzy mogą być leczeni preparatami genowymi. W przypadku preparatów niewirusowych ważna jest np. lokalizacja guza nowotworowego, która pozwala na nieobciążające pacjenta proste zabiegi kliniczne umożliwiające zarówno prowadzenie terapii (iniekcje wektora), jak i bezpośrednią ocenę jej skuteczności. Przedstawiony w niniejszej pracy konstrukt psFLT-1 jest obecnie wykorzystywany w prowadzonej w Centrum Onkologii-Instytucie w Warszawie próbie klinicznej antyangiogennej terapii genowej pacjentek chorych na raka sromu [24].


Podziękowania
Autorzy dziękują dr Monice Gos za pomoc w statystycznym opracowaniu wyników
Praca finansowana częściowo z grantu KBN 2 P05E 07126. .
Piśmiennictwo
1. Kontos CD, Annex BH. Angiogenesis. Curr Atheroscler Rep 1999; 1: 165-71. 2. Szala S, Radzikowski C. Podłoże molekularne angiogenezy nowotworów. Nowotwory 1997; 47: 1-19. 3. Wojtukiewicz MZ, Sierko E, Rak J. Contribution of the hemostatic system to angiogenesis in cancer. Semin Thromb Hemost 2004; 30: 5-20. 4. Malecki M, Kolsut P, Proczka R. Angiogenic and antiangiogenic gene therapy. Gene Ther 2005; 12 (Suppl): S159-S169. 5. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9: 669-76. 6. Kendall RL, Thomas KA. Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 10705-9. 7. Yamaguchi S, Iwata K, Shibuya M. Soluble Flt-1 (soluble VEGFR-1), a potent natural antiangiogenic molecule in mammals, is phylogenetically conserved in avians. Biochem Biophys Res Commun 2002; 291: 554-9. 8. Shibuya M. Vascular endothelial growth factor receptor family genes: when did the three genes phylogenetically segregate? Biol Chem 2002; 383: 1573-9. 9. Hornig CH, Weich HA. Soluble VEGF receptors. Angiogenesis 1999; 3: 33-9. 10. Mahasreshti PJ, Navarro JG, Kataram M, et al. Adenovirus-mediated soluble FLT-1 gene therapy for ovarian carcinoma. Clin Cancer Res 2001; 7: 2057-66. 11. Hasumi Y, Mizukami H, Urabe M, et al. Soluble FLT-1 expression suppresses carcinomatous ascites in nude mice bearing ovarian cancer. Cancer Res 2002; 62: 2019-23. 12. Boocock CA, Charnock-Jones DS, Sharkey AM, McLaren J, Barker PJ, Wright KA, Twentyman PR, Smith SK. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma. J Natl Cancer Inst 1995; 87: 506-16. 13. Mori A, Arii S, Furutani M, et al. Soluble Flt-1 gene therapy for peritoneal metastases using HVJ-cationic liposomes. Gene Ther 2000; 7: 1027-33. 14. Yang W, Arii S, Mori A, et al. sFlt-1 gene-transfected fibroblasts: a wound-specific gene therapy inhibits local cancer recurrence. Cancer Res 2001; 61: 7840-5. 15. Hoshida T, Sunamura M, Duda DG, et al. Gene therapy for pancreatic cancer using an adenovirus vector encoding soluble flt-1 vascular endothelial growth factor receptor. Pancreas 2002; 25: 111-21. 16. Takayama K, Ueno H, Nakanishi Y, Sakamoto T, Inoue K, Shimizu K, Oohashi H, Hara N. Suppression of tumor angiogenesis and growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor into a remote organ. Cancer Res 2000; 60: 2169-77. 17. Bainbridge JW, Mistry A, De Alwis M, Paleolog E, Baker A, Thrasher AJ, Ali RR. Inhibition of retinal neovascularisation by gene transfer of soluble VEGF receptor sFlt-1. Gene Ther 2002; 9: 320-6. 18. Gehlbach P, Demetriades AM, Yamamoto S, et al. Periocular gene transfer of sFlt-1 suppresses ocular neovascularization and vascular endothelial growth factor-induced breakdown of the blood-retinal barrier. Hum Gene Ther 2003; 14: 129-41. 19. Lai YK, Shen WY, Brankov M, Lai CM, Constable IJ, Rakoczy PE. Potential long-term inhibition of ocular neovascularisation by recombinant adeno-associated virus-mediated secretion gene therapy. Gene Ther 2002; 9: 804-13. 20. Malecki M, Jastrzębski Z, Przybyszewska M, Proczka R, Janik P. Antiangiogenic gene therapy: application of soluble FLT-1 receptor. Adv Clin Exp Med 2004; 13: 227-33. 21. Malecki M, Trembacz H, Szaniawska B, Przybyszewska M, Janik P. Vascular endothelial growth factor and soluble FLT-1 receptor interactions and biological implications. Oncol Rep 2005; 14: 1565-9. 22. Malecki M, Przybyszewska M, Janik P. In vitro and in vivo study of the expression vector encoding vascular endothelial growth factor. Arch Immunol Ther Exp 2001; 49: 243-6. 23. Sidky YA, Auerbach R. Lymphocyte-induced angiogenesis: a quantitative and sensitive assay of the graft-vs.-host reaction. J Exp Med 1975; 141: 1084-100. 24. Panek G, Gawrychowski K, Bidziński M, Krynicki R, Małecki M. Przypadek skutecznego zastosowania plazmidowego wektora ekspresyjnego psFLT i chemio-radioterapii do leczenia zaawansowanego miejscowo raka sromu. Przegląd Menopauzalny 2005; 4: 17-21.
Adres do korespondencji
dr n. med. Maciej Małecki
Zakład Biologii Komórki
Centrum Onkologii-Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie
ul. Roentgena 5
02-781 Warszawa
tel. +48 22 546 26 21
e-mail: mahan@poczta.wp.pl
Copyright: © 2006 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2019 Termedia Sp. z o.o. All rights reserved.
Developed by Bentus.
PayU - płatności internetowe