Polymorphisms Gly322Asp hMSH2 and Arg399Gln XRCC1 of the DNA repair system in breast cancer

Wstęp
Nowotwory złośliwe sutka są najczęściej występującymi nowotworami u kobiet. W Polsce notuje się prawie 10 000 nowych przypadków zachorowań rocznie. Oznacza to, że każdego roku na raka piersi zachoruje 30 kobiet na 100 000 [1]. Umieralność na raka piersi rośnie w tempie 1,6% rocznie, ponieważ jest on wykrywany zbyt późno. Tylko w 20% przypadków chorobę rozpoznaje się we wczesnym stadium zaawansowania, gdy szanse na wyleczenie są bardzo duże. Wśród wszystkich nieleczonych chorych na raka gruczołu piersiowego 10 lat przeżywa 5%. Dla leczonej pacjentki szansa przeżycia następnych 5 lub 10 lat bez postępu lub wznowienia procesu chorobowego jest uzależniona od stopnia zaawansowania schorzenia przy rozpoczęciu leczenia. Średni wskaźnik 10-letnich przeżyć dla wszystkich stopni zaawansowania wynosi ok. 40% [1]. Utrzymanie integralności genomowego DNA jest warunkiem koniecznym do prawidłowego funkcjonowania komórki. Zaburzenia struktury genomu mogą przyczyniać się do rozwoju wielu nowotworów złośliwych, w tym raka piersi. Polimorfizm genów naprawczych może wpływać na różnice w sprawności usuwania uszkodzeń materiału genetycznego, a tym samym kształtować podatność na rozwój choroby nowotworowej [2–5]. Dane literaturowe wskazują, że zaburzenia w naprawie DNA są związane z ryzykiem powstania raka piersi, które może korelować z wariantami polimorficznymi genów naprawy [6]. Zidentyfikowano ponad 130 genów naprawy DNA, w których odkryto szereg polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) [7, 8]. Ażeby zdefiniować rolę, jaką mogą odgrywać te warianty w modulowaniu ryzyka wystąpienia raka, należy określić ich znaczenie funkcjonalne. Zmienność w genach naprawy DNA może zostać wykorzystana klinicznie, w tym do oceny ryzyka wystąpienia danego rodzaju raka, jego prewencji i terapii. W pracy analizowano polimorfizm Gly322Asp genu hMSH2 i Arg399Gln genu XRCC1 u chorych na raka piersi.
Materiał i metody

Pacjentki
Badaniom poddano kobiety w wieku 55–82 lat (średnia wieku ±SD 68,8±6,68 roku), u których stwierdzono raka piersi. Materiał do badań stanowiła krew uzyskana od 150 pacjentek. Wszystkie nowotwory sklasyfikowano wg kryteriów Scarff-Bloom-Richardson. Grupę kontrolną stanowiły osoby, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej (n=129).
Izolowanie DNA
DNA izolowano z krwi przy użyciu zestawu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy) zgodnie z zaleceniem producenta.
Analiza polimorfizmu Gly322Asp genu hMSH2
Do badań polimorficznych wariantów wybranych genów naprawy DNA stosowano metodę PCR-RFLP (ang. polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Polimorfizm Gly322Asp genu hMSH2 był określany poprzez reakcję PCR-RFLP ze starterami o następujących sekwencjach: 5’GTTTTCACTAATGAGCTTGC3’, 5’AGTGGTATAATCATGTGGGT3’. Reakcja PCR przeprowadzona była w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400 thermal cycler. Mieszanina reakcyjna (25 ml) obejmowała 5 ng genomowego DNA, 0,2 mmol każdego ze starterów (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Germany), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 j.m. polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Warunki reakcji PCR były następujące: • 95°C – 5 min, • 95°C – 30 s, • 63°C – 30 s, • 72°C – 30 s, • 2® 3® 4 × 30 cykli, • 72°C – 5 min. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym HinfI przez 16 godz. w 37°C amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 7-procentowym żelu poliakryloamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle UV. Każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów: Gly/Gly, Gly/Asp, Asp/Asp. Analiza polimorfizmu Arg399Gln genu XRCC1 Polimorfizm Arg399Gln genu XRCC1 był określany poprzez reakcję PCR-RFLP ze starterami o następujących sekwencjach: 5’CAAGTACAGCCAGGTCCTAG3’ 5’CCTTCCCTCATCTGGAGTAC3’. Reakcja PCR przeprowadzona była w termocyklerze Perkin-Elmer/Gene Amp, PCR System 2400 thermal cycler. Mieszanina reakcyjna (25 ml) obejmowała 5 ng genomowego DNA, 0,2 mmol każdego ze starterów (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Germany), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP i 1 j.m. polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Warunki reakcji PCR były następujące: • 95°C – 5 min, • 95°C – 20 s, • 58°C – 20 s, • 72°C – 20 s, • 2® 3® 4 × 35 cykli, • 72°C – 3 min. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym BcnI przez 2 godz. w 37°C amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 7-procentowym żelu poliakryloamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle UV. Każda próbka przypisywana była do jednego z trzech genotypów: Arg/Arg, Arg/Gln lub Gln/Gln.
Analiza statystyczna
Rejestrowana liczba każdego z genotypów była porównywana z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego-Weinberga z użyciem testu χ². Istotność różnic pomiędzy częstościami alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniana była testem χ²; p<0,05 było określane jako wynik statystycznie znaczący.
Wyniki
W tab. I przedstawiono rozkład genotypów polimorfizmu Gly322Asp genu hMSH2 w grupie chorych na raka piersi i w grupie kontrolnej. Oba rozkłady nie różniły się znacząco (p>0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Nie stwierdzono różnic w częstościach alleli Gly i Asp pomiędzy pacjentami i kontrolą. W tab. II zaprezentowano rozkład genotypów Arg399Gln genu XRCC1 w grupie chorych na raka piersi i w grupie kontrolnej. Oba rozkłady nie różniły się znacząco (p>0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Nie stwierdzono różnic w częstościach występowania alleli Arg i Gln pomiędzy chorymi i grupą kontrolną. Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy rozkładami genotypów w grupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworu a rozkładem przewidywanym przez prawo Hardy’ego-Weinberga (p>0,05). Nie odnotowano różnic w częstościach występowania alleli Gly i Asp oraz Arg i Gln pomiędzy badanymi grupami (p>0,05).
Dyskusja
Gen hMSH2 znajduje się na chromosomie 2 w obszarze p22-p21 i zawiera 3145 bp i 13 eksonów. Udział hMSH2 w patogenezie raka jest silnie udokumentowany, ponieważ gen ten wraz z hMLH1 ulega zaburzeniom w rodzinnym, niepolipowatym raku jelita grubego (HNPCC) [9]. Ta rodzinna przypadłość predysponuje nie tylko do raka jelita grubego, ale również do raka endometrium, żołądka, jajników i dróg żółciowych [10]. Oprócz tego mutacje w hMSH2 są wykrywane w sporadycznych rakach jelita grubego, endometrium [11], żołądka [12], głowy i szyi [13] i prostaty [14]. Gen XRCC1 (X-ray repair crosscomplementing group 1) koduje białko uczestniczące w szlaku naprawy DNA BER. Położony jest w chromosomie 19 (19q13.2), zajmuje ok. 31,9 kpz i zawiera 17 eksonów [15]. Ulega on ekspresji na wysokim poziomie w różnych tkankach. Transkrypty podlegają alternatywnemu składaniu, przez co XRCC1 może kodować nawet 16 białek. Dotychczas stwierdzono istnienie 37 miejsc polimorficznych w obrębie genu XRCC1, z których 14 powoduje zmianę kodowanego aminokwasu, a 4 występują w populacji z częstością 3% lub większą [15]. Trzy z nich (Arg194Trp, Arg280His i Arg399Gln) przebadano pod względem epidemiologicznym [4]. Allel 194Trp występuje w grupach kontrolnych badań epidemiologicznych z częstością 0,06–0,35 [8]. Według wyników uzyskanych w większości z nich już w układzie heterozygotycznym zmniejsza on ryzyko rozwoju nowotworów wielu typów, m.in. piersi, płuc i pęcherza [3, 15, 16]. Polimorfizm w pozycji 399 (ekson 10) związany jest z podstawieniem Arg® Gln w domenie BRCT I wiążącej polimerazę poli (ADP-rybozy). W populacjach osób bez nowotworów (grupy kontrolne badań epidemiologicznych), częstość allelu 399Gln wynosi 0,14–0,39. Polimorfizm ten może mieć wpływ na ryzyko rozwoju choroby nowotworowej, powodując zarówno jego wzrost, jak i spadek, w zależności od typu i lokalizacji raka [17]. Stwierdzono korelację między obecnością allelu 399Gln a poziomem uszkodzeń DNA i mutacji, jednak wg badań efektywności naprawy pęknięć jednoniciowych oba warianty cechuje zbliżona sprawność; polimorfizm Arg399Gln może więc mieć niewielki wpływ na domenę BRCT I i funkcjonowanie XRCC1 [18]. W przedstawionej pracy nie stwierdzono związku pomiędzy polimorfizmami Gly322Asp genu hMSH2 i Arg399Gln genu XRCC1 a rozwojem raka piersi. Wyniki sugerują, że polimorfizmy mogą nie być bezpośrednio związane z występowaniem i rozwojem raka piersi, jednakże konieczne są badania większej populacji dla potwierdzenia tego przypuszczenia.
Piśmiennictwo
1. Didkowska JU. Epidemiologia nowotworów złośliwych piersi w Polsce. Nowotwory 2007; 57: 15-6. 2. Shen MR, Jones IM, Mohrenweiser H. Nonconservative amino acid substitution variants exist at polymorphic frequency in DNA repair genes in healthy humans. Cancer Res 1998; 58: 604-8. 3. Shia J, Ellis NA, Klimstra DS. The utility of immunohistochemical detection of DNA mismatch repair gene proteins. Virchows Arch 2004; 445: 431-41. 4. Goode EL, Ulrich CM, Potter JD. Polymorphisms in DNA repair genes and associations with cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11: 1513-30. 5. Duell EJ, Millikan RC, Pittman GS, et al. Polymorphisms in the DNA repair gene XRCC1 and breast cancer. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2001; 10: 217-22. 6. De Ruyck K, Wilding CS, Van Eijkeren M, et al. Microsatellite polymorphisms in DNA repair genes XRCC1, XRCC3 and XRCC5 in patients with gynecological tumors: association with late clinical radiosensitivity and cancer incidence. Radiat Res 2005; 164: 237-44. 7. Wood RD, Mitchell M, Sgouros J, Lindahl T. Human DNA repair genes. Science 2001; 291: 1284-9. 8. Ford BN, Ruttan CC, Kyle VL, et al. Identification of single nucleotide polymorphisms in human DNA repair genes. Carcinogenesis 2000; 21: 1977-81. 9. Charames GS, Bapat B. Genomic instability and cancer. Curr Mol Med 2003; 3: 589-96. 10. Lynch HT, Smyrk T, Lynch JF. Molecular genetics and clinical-pathology features of hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma (Lynch syndrome): historical journey from pedigree anecdote to molecular genetic confirmation. Oncology 1998; 55: 103-8. 11. Caduff RF, Johnston CM, Svoboda-Newman SM, et al. Clinical and pathological significance of microsatellite instability in sporadic endometrial carcinoma. Am J Pathol 1996; 148: 1671-8. 12. Renault B, Calistri D, Buonsanti G, et al. Microsatellite instability and mutations of p53 and TGF-beta RII genes in gastric cancer. Hum Genet 1996; 98: 601-7. 13. Field JK, Kiaris H, Howard P, et al. Microsatellite instability in squamous cell carcinoma of the head and neck. Br J Cancer 1995; 71: 1065-9. 14. Watanabe M, Imai H, Kato H, et al. Microsatellite instability in latent prostate cancers. Int J Cancer 1996; 69: 394-7. 15. Trask B, Fertitta A, Christensen M, et al. Fluorescence in situ hybridization mapping of human chromosome 19: cytogenetic band location of 540 cosmids and 70 genes or DNA markers. Genomics 1993; 15: 133-45. 16. David-Beabes GL, London SJ. Genetic polymorphism of XRCC1 and lung cancer risk among African-Americans and Caucasians. Lung Cancer 2001; 34: 333-9. 17. Stern MC, Umbach DM, van Gils CH, et al. DNA repair gene XRCC1 polymorphisms, smoking, and bladder cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001; 10: 125-31. 18. Hu JJ, Mohrenweiser HW, Bell DA, et al. Symposium overrview: genetic polymorphisms in DNA repair and cancer risk. Toxicol Appl Pharmacol 2002; 185: 64-73.