Von Willebrand factor (vWF) in plasma of patients with pancreatic carcinoma

WSTĘP


Eric A. von Willebrand w roku 1926 jako pierwszy opisał u mieszkańców Wysp Alandzkich dziedziczne, poważne zaburzenia krzepliwości krwi. W roku 1957 stwierdzono, że przyczyną takich krwawień jest niedobór lub brak pewnego wysokocząsteczkowego białka osocza. Określenie jego struktury było możliwe dopiero w 1985 roku, z chwilą odkrycia i sklonowania genu dla czynnika von Willebranda (vWF). Gen kodujący ten czynnik jest zlokalizowany na końcu krótkiego ramienia 12. chromosomu. W 1994 roku J. Evan Sadler wprowadził nową fenotypową klasyfikację choroby von Willebranda, a w 1995 roku metodą inżynierii genetycznej uzyskano po raz pierwszy rekombinowany vWF [1].

Czynnik von Willebranda jest glikoproteiną, syntetyzowaną przez komórki śródbłonka i megakariocyty, skąd jest uwalniany do krwi w postaci multimerów różnej wielkości. Jego stężenie w osoczu ludzi zdrowych wynosi 5-10 μg/ml [2, 3].



W hemostazie pierwotnej czynnik von Willebranda pełni kluczową rolę w przyleganiu płytek krwi do uszkodzonych miejsc w śródbłonku naczyń, co wiąże się z późniejszą agregacją płytek. Ze strony płytek krwi w powyższe procesy zaangażowane są dwie glikoproteiny: GP Ib oraz GP IIb/IIIa. Zdolność wiązania się vWF z GP Ib i w związku z tym przyleganie płytek do uszkodzonego naczynia zależy od wielkości sił ścinania. Glikoproteina IIb/IIIa jest adhezyną płytkową, która w procesach przyklejania płytek krwi do kolagenu za pośrednictwem vWF pełni rolę 2-rzędowego receptora. W hemostazie wtórnej czynnik von Willebranda wiąże się z czynnikiem VIII krzepnięcia, tworząc białkowy kompleks w stosunku 50-100:1 (monomery vWF:monomer cz. VIII). W kompleksie tym vWF pełni funkcję nośnika i stabilizatora, ochraniając czynnik VIII przed proteolityczną degradacją. Pod wpływem trombiny kompleks ten ulega rozpadowi, a uwolniony czynnik VIII łącząc się z fosfolipidami aktywuje procesy krzepnięcia krwi [4, 5].
Przez wiele lat czynnik von Willebranda znany był tylko jako czynnik warunkujący procesy hamowania krwawienia. Obecnie coraz częściej podkreślana i wykorzystywana jest jego rola jako markera uszkodzenia śródbłonka naczyniowego [6, 7].

Celem pracy jest ocena stężenia czynnika von Willebranda w osoczu chorych na raka trzustki.



MATERIAŁ KLINICZNY


Badaniami objęto grupę chorych na raka trzustki, leczonych w Klinice Chirurgii Przewodu Pokarmowego i Chirurgii Ogólnej AM we Wrocławiu oraz grupę ludzi zdrowych.

Grupę kontrolną (A) stanowiły 32 osoby zdrowe (15 kobiet i 17 mężczyzn) w wieku 41-73 lat (Me 54,0). Grupa chorych z rakiem trzustki to 32 osoby (19 kobiet i 13 mężczyzn) w wieku 32-78 lat (Me 63,5). U wszystkich chorych uzyskano w materiale pobranym śródoperacyjnie, potwierdzenie histopatologiczne raka części zewnątrzwydzielniczej trzustki. U 1 chorej stwierdzono cystadenocarcinoma, u 1 chorego - carcinoma anaplasticum, a u pozostałych 30 chorych - adenocarcinoma. U większości chorych nowotwór był w zaawansowanym stadium: T₃ stwierdzono u 25 osób, T - u 6, a T₁ tylko u 1 chorej. Obecność przerzutów w okolicznych węzłach chłonnych (N₁) stwierdzono u 27 osób, a przerzuty odległe (M₁) u 18 chorych. U żadnego z badanych chorych nie stwierdzono klinicznych objawów powikłań zakrzepowych. Do czasu pobrania próbek krwi chorzy ci nie otrzymywali cytostatyków ani nie przechodzili radioterapii.

Resekcję głowy trzustki sposobem Whipple'a (w tym u 1 chorej z rekonstrukcją żyły wrotnej) wykonano u 7 chorych, paliatywne zespolenia omijające - u 19 osób, a u 6 chorych zabieg operacyjny był ograniczony do laparotomii zwiadowczej z powodu zaawansowania procesu nowotworowego. Na przeprowadzenie badań i przedstawienie w pracy wyników uzyskano zgodę Komisji Etyki Badań Naukowych Akademii Medycznej we Wrocławiu oraz zgodę każdego z badanych na pobranie krwi do celów naukowych.



METODY BADAŃ


Krew do badań pobierano z żyły łokciowej 2-3 dni przed planowanym zabiegiem operacyjnym w ilości 4,5 ml, do próbówek zawierających 0,5 ml cytrynianu sodu. Po odwirowaniu osocze przechowywano w temp. minus 20°C, a oznaczenia przeprowadzono jednoczasowo po zebraniu wszystkich próbek.
Oznaczenia stężenia czynnika von Willebranda przeprowadzono przy użyciu zestawu immunoenzymatycznego firmy ASSERACHROM vWF, ROCHE, Francja zgodnie z instrukcją podaną przez producenta. Wartości stężenia vWF w badanych osoczach wyrażono w procentach w odniesieniu do stężenia, jakie występuje w zdrowej populacji ludzi dorosłych. Istotność różnic w badanych grupach o rozkładzie różnym od normalnego, sprawdzono testem nieparametrycznym Kruskala-Wallisa.



WYNIKI


Na ryc. przedstawiono rozkład stężeń vWF w osoczu ludzi zdrowych i chorych na raka trzustki. Wyniki w grupie ludzi zdrowych (A) cechował mały rozrzut, mniejszy niż zakres wartości fizjologicznych proponowany przez producenta testu. Stężenia vWF powyżej górnej granicy zakresu wahań u ludzi zdrowych wykazywało 37,5 proc. chorych z rakiem trzustki (B), natomiast stężenia niższe niż dolna granica wahań w grupie kontrolnej stwierdzono u 6,3 proc. chorych. Wyniki będące poza zakresem wahań wyznaczonym przez grupę referencyjną dotyczyły więc 43,8 proc. badanych chorych. Różnice mediany stężeń uzyskanych w porównywanych grupach były znamienne statystycznie na poziomie istotności p<0,05 (tab. 1.). Natomiast porównanie mediany stężenia vWF w osoczu w grupie chorych z rakiem trzustki w zależności od obecności odległych przerzutów nie wykazało różnic istotnych statystycznie (tab. 2.).



OMÓWIENIE


W praktyce klinicznej spotykane są częste powikłania zakrzepowe u chorych z rakiem trzustki. Na zakrzepowe zapalenie żył jako wczesny objaw raka zwrócił uwagę po raz pierwszy Trousseau w roku 1865. W badaniach sekcyjnych niektórzy autorzy szacują częstość ich występowania nawet do 90 proc. populacji tych chorych [8]. Szczególnie istotnie zwiększa się gotowość zakrzepowa i skłonność do występowania zakrzepicy u chorych z gruczolakorakami produkującymi śluz [9]. Patomechanizm powikłań zakrzepowo-zatorowych stwierdzanych w chorobie nowotworowej jest złożony [9, 10, 11]. Opisuje je aktualna do dzisiaj triada Virchowa z 1865 r. Zgodnie z tą teorią, zakrzepica jest konsekwencją upośledzenia przepływu krwi, nieprawidłowości dotyczących ściany naczyniowej, a także zaburzeń w składzie krwi [12]. Zastój naczyniowy może być wywołany uciskiem guza na naczynia, a w warunkach zastoju upośledzona jest eliminacja aktywowanych czynników krzepnięcia. Zaburzenia w ścianie naczyniowej mogą wynikać z bezpośredniego naciekania guza na naczynia i uszkodzenia śródbłonka z utratą jego naturalnego potencjału przeciwzakrzepowego. Nieprawidłowości składu krwi związane są przede wszystkim z obecnością komponentów komórek nowotworowych, zdolnych do inicjowania adhezji i agregacji płytek krwi, tworzenia trombiny, produkcji ADP i aktywacji metabolizmu kwasu arachidonowego [12]. Najważniejszą rolę w aktywacji układu krzepnięcia u chorych na nowotwory złośliwe odgrywają prokoagulanty komórek nowotworowych, takie jak czynnik tkankowy (ang. tissue factor, TF), prokoagulant nowotworowy (ang. cancer procoagulant, CP), HLA-DR (antygen z grupy MHC), PAA/PCA (ang. platelet aggregating activity/procoagulant activity) - aktywator płytek krwi i czynnika X, glikoproteinę śluzu oraz czynniki nieprokoagulacyjne: czynnik V i receptor czynnika V. Czynnik tkankowy odgrywa kluczową rolę w krzepnięciu, ale czynny jest też w powstawaniu przerzutów nowotworowych i wspomaga angiogenezę, natomiast prokoagulant nowotworowy aktywuje bezpośrednio czynnik X [13]. Czynnikiem pośrednim, zależnym od komórek guza jest również aktywacja monocytów/makrofagów, które są źródłem czynnika tkankowego (TF) oraz wspomagają tworzenie kompleksu protrombinazy i dostarczają substancji bezpośrednio aktywujących czynnik X. Istotnym elementem jest również aktywacja komórek śródbłonka naczyniowego przez pochodzące z komórek nowotworowych cytokiny.



Równie ważną rolę w działaniu prozakrzepowym u chorych na raka odgrywa również interakcja komórek guza ze śródbłonkiem naczyń oraz płytkami krwi. Liczne komórki nowotworowe mają na swojej powierzchni m.in. kompleks podobny do integryny αIIbβ3, czyli kompleksu GPIIb-IIa oraz tworzą filopodia, ułatwiające im przybliżenie się do płytek krwi, co sprawia, że komórki raka mogą w krążeniu tworzyć agregaty z płytkami krwi. Uszkodzenie śródbłonka w wyniku naciekania przez guz prowadzi do ilościowych i jakościowych zmian czynnika von Willebranda. Badania kliniczne wykazują, że wysokie stężenie vWF w osoczu jest odbiciem nie tylko dysfunkcji komórek śródbłonka naczyniowego, ale także przypisuje się mu duże znaczenie prognostyczne w występowaniu zakrzepicy [1] i dlatego w niniejszej pracy przeprowadzono ocenę stężenia tego czynnika w osoczu chorych na raka trzustki.

W przedstawionych badaniach chorzy na raka trzustki wykazywali wyższe, istotne statystycznie, stężenie czynnika von Willebranda w osoczu w porównaniu z wynikami u ludzi zdrowych, co potwierdza większe ryzyko powikłań zakrzepowych u tych chorych.



Więcej trudności sprawia interpretacja wyników u pacjentów z rakiem trzustki, które były niższe od dolnej granicy zakresu referencyjnego. Poza genetycznie uwarunkowanym niedoborem vWF, który nie występował u badanych chorych, spotykany bywa nabyty zespół von Willebranda. Uwarunkowany jest on pojawieniem się przeciwciał przeciwko vWF, proteolizą tego czynnika lub obniżeniem stężenia wysokocząsteczkowych multimerów. Spotykany bywa jednak w przebiegu chorób limfoproliferacyjnych i gammapatii monoklonalnych [14]. Można sugerować, ze niedobór występujący u chorych na raka trzustki to niedobór ze zużycia i przemawiający za istnieniem powikłań zakrzepowych, nawet jeśli nie zawsze są potwierdzane klinicznie. Wydaje się więc celowym nawet mimo braku objawów klinicznych, skłaniać się do częstszego wykonywania nieinwazyjnych badań naczyniowych w poszukiwaniu zakrzepów celem prawidłowego leczenia, a przede wszystkim do wdrażania profilaktyki przeciwzakrzepowej, szczególnie u chorych z rakiem trzustki kwalifikowanych do leczenia operacyjnego.

Formowanie agregatów fibryny i płytek krwi przyczynia się do uszkodzenia komórek śródbłonka naczyniowego, a czynnik von Willebranda pełni kluczową rolę w przyleganiu płytek krwi do uszkodzonych miejsc w śródbłonku naczyń, co wiąże się z późniejszą agregacją płytek krwi [12]. Szczególnie w małych naczyniach krwionośnych, o dużym module ścinania (ang. high shear rate), niezbędne do adhezji płytek jest pośrednictwo vWF. Przyjmuje się, że komórki nowotworowe przerzutując przekraczają barierę ściany naczyniowej właśnie w miejscu uszkodzenia komórek śródbłonka [14]. Uważa się również, że zaburzenia krzepnięcia krwi są nie tylko powikłaniem procesu nowotworowego, ale wykazują także związek przyczynowy z rozwojem nowotworu - aktywacja krzepnięcia krwi gospodarza ma bowiem wpływ na miejscowy rozwój guza i powstawanie przerzutów [12]. Tymczasem w przeprowadzonych badaniach nie wykazano różnic istotnych statystycznie stężenia vWF u chorych z obecnymi odległymi przerzutami w stosunku do osób bez odległych przerzutów. Uzyskany wynik potwierdza spostrzeżenia, że zaburzenia krzepnięcia krwi nie towarzyszą wyłącznie zaawansowanym fazom choroby nowotworowej, ale mogą także zachodzić u pacjentów we wczesnym stadium choroby [12].



WNIOSEK


Przedstawione badania pozwalają stwierdzić, że podwyższone stężenie czynnika von Willebranda w osoczu chorych na raka trzustki jest jednym z wielu elementów tłumaczących znaczną skłonność do powikłań zakrzepowych u tych chorych.



PIŚMIENNICTWO

1. Jastrzębska M. Czynnik von Willebranda a ryzyko chorób układu krążenia. Czynniki Ryzyka 1998; 19: 36-43.
2. Favaloro EJ. Detection of von Willebrand disorder and identification of qualitative von Willebrand factor defects. Am J Clin Pathol 2000; 114: 608-18.
3. Moroi M. Jung SM, Nomura S, Sekiguchi S, Ordinas A, Diaz-Ricart M. Analysis of the involvement of the von Willebrand factor-glycoprotein Ib interaction in platelet adhesion to a collagen-coated surface under conditions. Blood 1997; 90: 4413-24.
4. Ajzenberg N, Ribba AS, Rastegar-Lari G, Meyer D, Baruch D. Effect of recombinant von Willebrand factor reproducing type 2B or type 2M mutations on shear-induced platelet aggregation. Blood 2000; 95: 3796-803.
5. Sadler JE. Von Willebrand factor. J Biol Chem 1991; 266: 22777-80.
6. Colen KL, Crisera ChA, Rose MI, Connelly PR, Longaker MT, Gittes GK. Vascular development in the mouse embryonic pancreas and lung. J Ped Surg 1999; 34: 781-85.
7. Kuehn R, Lelkes PI, Bloechle C, Niendorf A, Izbicki JR. Angiogenesis, angiogenic growth factors, and cell adhesion molecules are upregulated in chronic pancreatic diseases: Angiogenesis in chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Pancreas 1999; 18: 96-103.
8. Piotrowski Z, Wojtukiewicz, Zimoch L, Jaromin J, Puchalski Z, Bielawiec M. Badania nad obecnością fibryny w tkankach raka trzustki. Pol Przegl Chir 1998; 70: 478-83.
9. Bick RL. Coagulation abnormalities in malignancy: a review. Sem Thromb Hemost 1992; 18: 353-72.
10. Lindahl AK, Odegaard OR, Sandset PM, Harbitz TB. Coagulation inhibition and activation in pancreatic cancer. Changes during progress of disease. Cancer 1992; 70: 2067-72.
11. Andrén-Sandberg A, Lecander I, Martinsson G, Astedt B. Peaks in plasma plasminogen activator inhibitor-1 concentration may explain thrombotic evens in cases of pancreatic carcinoma. Cancer 1992; 69: 2884-87.
12. Wojtukiewicz MZ, Rucińska M. Aktywacja krzepnięcia krwi u chorych na nowotwory: implikacje kliniczne. Nowotwory 1999; 49: 381-91.
13. Gordon SG. Cancer cell procoagulants and their implications. Hematol Oncol Clin North Am 1992; 6: 1359-74.
14. Jeleńska MM. Czynnik von Willebranda i nowa klasyfikacja jego wrodzonych niedoborów lub dysfunkcji. Acta Haematol Pol 1997; 28, supl. 1, 35-45.
15. Radzikowski Cz. Przerzuty nowotworowe - problem biologiczny, dylemat prognostyczny i terapeutyczny. Nowotwory 1995; 45: 184-201.



ADRES DO KORESPONDENCJI

dr med. Krystyna Markocka-Mączka

Katedra i Klinika Chirurgii Przewodu
Pokarmowego
i Chirurgii Ogólnej

Akademia Medyczna

ul. Traugutta 57/59

50-417 Wrocław

tel. (071) 370 02 50