hOGG1 Ser326Cys and XRCC1 Arg399Gln genetics polymorphism in DNA repair genes by base excision repair pathway (BER) in postmenopausal women with endometrial cancer

Wstęp

Rak endometrium zajmuje czwarte miejsce wśród nowotworów u kobiet. Około 80% przypadków diagnozowanych jest w okresie po menopauzie [1, 2].

Proces transformacji nowotworowej endometrium nie jest do końca poznany. Wpływa na niego wiele różnorodnych czynników ryzyka. Jest to proces wielostopniowy. Czynniki ryzyka wpływają na organizm nie bezpośrednio, ale np. w wyniku indukcji reaktywnych form tlenu, które uszkadzają strukturę DNA i powodują punktowe mutacje w obrębie chromosomów. Niektóre z tych mutacji doprowadzają do transformacji prawidłowych komórek w nowotworowe.

Aby chronić komórki przed uszkodzeniami oksydacyjnymi, komórki wykształciły następujące mechanizmy naprawy DNA: szlak naprawy przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia, wycinanie zasad azotowych, wycinanie nukleotydów, naprawa błędnie sparowanych zasad azotowych, naprawa przez rekombinację (homologiczną i niehomologiczną) [3].

Gen hOGG1 (the human oxoguanine glycosylase 1) i XRCC1 (X-ray repair cross-complementing 1) należą do grupy genów uczestniczących w mechanizmie naprawy przez wycinanie zasad azotowych (base excition repair – BER) i są kluczowe w tym procesie [3, 4]. Mechanizm BER naprawia wszystkie oksydacyjne uszkodzenia DNA oraz pęknięcia pojedynczych nici [4]. Uszkodzenia te mogą przyczyniać się do rozwoju wielu nowotworów, w tym raka endometrium.

Istnieją doniesienia piśmiennictwa o związku pomiędzy polimorfizmem w kodonie 326 genu hOGG1 oraz polimorfizmem w kodonie 399 genu XRCC1 a ryzykiem wystąpienia różnych nowotworów [4–18].

Transwersja G → C w pozycji 1245 genu hOGG1 powoduje podstawienie Ser → Cys w kodonie 326 (polimorfizm Ser326Cys), który może być związany z rakiem płuc [7, 8], żołądka [9] i krtani [10]. Z drugiej strony allel 326Cys hOGG1 może pełnić funkcję ochronną rozwoju raka piersi u kobiet w Europie [11].

W przypadku genu XRCC1 podstawienie aminokwasowe 399Arg do Gln może powodować wzrost ryzyka raka krtani, prostaty, trzustki, płuc i piersi [12–18]. Z drugiej strony polimorfizm w kodonie 399 genu XRCC1 może powodować redukcję ryzyka raka pęcherza moczowego [19].

Niewiele wiadomo o roli polimorfizmów genu hOGG1 i XRCC1 w raku endometrium. W dostępnym piśmiennictwie niewielu badaczy analizowało związki pomiędzy polimorfizmami tych genów a rakiem endometrium [20–22].

Dlatego celem prezentowanych badań stało się określenie relacji pomiędzy polimorfizmem Arg399Gln genu XRCC1 i Ser326Cys genu hOGG1 a rakiem endometrium u polskich kobiet.

Materiał i metody

Pacjentki

W badaniach brało udział 220 pacjentek z histologicznie potwierdzoną diagnozą raka endometrium. Charakterystykę pacjentek przedstawia tabela I. Próbki guzów utrwalonych w parafinie zostały uzyskane od kobiet w wieku pomenopauzalnym, chorych na raka endometrium, leczonych w Klinice Chorób Menopauzy Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w latach 2004–2009. Wszystkie nowotwory sklasyfikowano wg kryteriów Międzynarodowej Federacji Ginekologów i Położników (Federation of Gynaecology and Obstetrics – FIGO). DNA uzyskany z prawidłowego endometrium stanowił grupę kontrolną (n = 220).

Izolacja DNA

DNA był izolowany przy użyciu zestawu QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) zgodnie z instrukcją producenta.

Polimorfizm hOGG1

Polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 był określony za pomocą techniki PCR-RFLP z zastosowaniem starterów 5’-GGAAGGTGCTTGGGGAAT-3’ i 5’-ACTGTCACTAGTCTCACCAG-3’. Mieszanina reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction – PCR) (25 μl) obejmowała 100 ng DNA, 12,5 pmol każdego ze starterów, 0,2 mmol/l dNTP, 2 mmol/l of MgCl2 i 1 U polimerazy Taq DNA (TaKaRa, Japonia). Produkt PCR poddawano elektroforezie w 7-procentowym żelu poliakrylamidowym (polyacrylamide gel – PAGE) i wizualizowano w wyniku barwienia bromkiem etydyny. Fragment długości 100 pz odpowiadał genotypowi Cys/Cys. Heterozygotę Ser/Cys charakteryzowała obecność dwóch pasm 100 i 200 pz, natomiast homozygotę Ser/Ser jedno pasmo 200 pz. Reakcja PCR została przeprowadzona w termocyklerze DNA Thermal Cycler (GeneAmp PCR System 2400; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Warunki reakcji były następujące: wstępna denaturacja 95°C przez 5 min, właściwe 35 cykli: denaturacja 95°C przez 30 s, wydłużanie 56°C przez 30 s, wydłużanie 72°C przez 30 s, końcowe wydłużanie 7 min w 72°C. Produkt PCR był trawiony 1 U SatI w 37°C.

Polimorfizm XRCC1

Analiza polimorfizmu genu XRCC1 została przepro-

wadzona techniką PCR-RFLP z zastosowaniem starte-

rów 5’-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3’ i 5’-TCCTCCAGCC-TTTTCTGATA-3’. Reakcję PCR przeprowadzono w objętości 25 μl zawierajacej 12,5 pmol każdego startera,

0,2 mmol/l dNTP, 3 mmol/l MgCl2, 100 ng DNA i 1 U polimerazy Taq DNA (TaKaRa, Japonia). Produkt PCR był trawiony całą noc 10 U MspI w 37ºC. Allel dziki Arg charakteryzowała obecność dwóch pasm – 375 i 240 pz, allel Gln obecność pasma długości 614 pz.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzano, stosując program komputerowy STATISTICA ver. 5.0 (StatSoft, Inc.). Wynik uznawano za istotny statystycznie przy poziomie istotności p < 0,05. Analiza statystyczna rozkładu genotypów oraz alleli w grupie badanej i kontrolnej przeprowadzona została po wcześniejszym potwierdzeniu, że otrzymane układy pozostają w stanie równowagi wg reguły Hardy’ego-Weinberga.

Wyniki

Wyniki rozkładu genotypów XRCC1 (Arg399Gln) w raku endometrium i kontroli przedstawia tabela II. Stwierdzono statystycznie istotne różnice pomiędzy badanymi grupami (p < 0,05). U kobiet z rakiem endometrium częstości alleli wynosiły odpowiednio 56,8 i 43,2%, dla alleli Arg i Gln XRCC1, w grupie kontrolnej 65,9 i 34,1% dla tych samych alleli. Allel 399Gln występował ze statystycznie istotnie większą częstością u kobiet z rakiem endometrium w porównaniu z grupą kontrolną [OR = 1,25, 95% CI (1,02–1,55; p = 0,035)].

Nie wykazano różnic w częstości genotypów polimorfizmu genu hOGG1 pomiędzy grupą badaną i kontrolną (tab. III) (p > 0,05).

W celu wyjaśnienia, czy polimorfizm XRCC1

(Arg399Gln) i hOGG1 (Ser326Cys) zwiększa ryzyko rozwoju raka endometrium, porównywano rozkład genotypów w zależności od stopnia zaawansowania wg FIGO (tab. III).

Stopień zaawansowania histologicznego był określony we wszystkich przypadkach (n = 220) – 100 przypadków stopnia I, 110 przypadków stopnia II i 10 stopnia III. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów polimorfizmów XRCC1 Arg399Gln i hOGG1 Ser326Cys w grupach różnego stopnia zaawansowania nowotworu (p > 0,05) (tab. IV).

Nie zaobserwowano statystycznie znaczących różnic w częstości alleli i genotypów XRCC1 Arg399Gln i hOGG1 Ser326Cys pomiędzy czynnikami ryzyka raka endometrium, wskaźnikiem masy ciała (body mass index – BMI), hormonalną terapią zastępczą (HTZ), krwawieniami, cukrzycą, nadciśnieniem.

Dyskusja

Prezentowane badania dotyczyły analizy polimorfizmów XRCC1 Arg399Gln i hOGG1 Ser326Cys, genów naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych, w raku endometrium u polskich kobiet w wieku pomenopauzalnym. Wykazano, że polimorfizm genu XRCC1 może być związany z tym nowotworem w przeciwieństwie do hOGG1.

Chociaż znane są różne polimorfizmy pojedynczych nukleotydów genu XRCC1, to tylko trzy spośród nich (Arg194Trp, Arg280His i Arg399Gln) mogą być rozważane jako potencjalne czynniki ryzyka rozwoju nowotworów [3].

Sugeruje się, że powyższe polimorfizmy mogą zmieniać wydajność XRCC1 w procesie naprawy DNA, zwłaszcza polimorfizm w kodonie 399.

Polimorfizm XRCC1 Arg399Gln jest badany jako czynnik ryzyka rozwoju różnych nowotworów. Dane literaturowe wskazują, że XRCC1 Arg399Gln może być związany ze wzrastającym ryzykiem raka płuc [23, 24], głowy i szyi [25] oraz żołądka [26].

Nie zwiększa natomiast ryzyka rozwoju raka pęcherza moczowego [27], przełyku [28] oraz czerniaka [29].

W przypadku raka piersi doniesienia piśmiennictwa są sprzeczne. Smith i wsp. nie znaleźli związku pomiędzy genotypem XRCC1 399 Gln/Gln a tym nowotworem [30]. Jednakże wyniki te nie zostały potwierdzone przez innych badaczy [31–33].

W piśmiennictwie niewiele jest danych o znaczeniu polimorfizmu XRCC1 Arg399Gln w raku endometrium [21]. Tylko praca De Ruyck K i wsp. wykazała, że polimorfizmy pojedynczych nukleotydów XRCC1 w kombinacji z SNP innych genów (XRCC3 i hOGG1) są związane ze zwiększeniem czułości pacjentek na radioterapię (RT) [21].

W prezentowanej pracy allel 399Gln zwiększał ok. 1,25 razy ryzyko rozwoju raka endometrium w porównaniu z allelem 399Arg. Istnieje możliwość, że allel 399G pozostaje w związku z innymi nieznanymi mutacjami zlokalizowanymi poza regionem kodującym genu XRCC1, co może być istotne dla stężenia tego białka w osoczu.

Jednakże w przedstawionych badaniach nie wykazano związku pomiędzy polimorfizmem genu hOGG1 Ser326Cys a rakiem endometrium. Jest to zgodne z danymi piśmiennictwa [21, 22]. Krupa i wsp. sugerują, że polimorfizm Ser326Cys hOGG1 może nie być bezpośrednio związany z rozwojem raka endometrium w polskiej populacji oraz nie może być niezależnym markerem tej choroby [22].

Poza tym w pracy nie stwierdzono związku pomiędzy badanymi polimorfizmami a czynnikami ryzyka raka endometrium, jak: BMI, liczba ciąż, HTZ, krwawienia, cukrzyca i nadciśnienie.

Wniosek

Wyniki przedstawionych badań sugerują, że polimorfizm Arg399Gln genu XRCC1 może być związany z rakiem endometrium w polskiej populacji.

Dlatego też można stwierdzić, że system naprawy DNA przez wycinanie zasad azotowych odgrywa istotną rolę w powstawaniu raka endometrium. Dalsze badania są konieczne do potwierdzenia tego przypuszczenia.

Piśmiennictwo

 1. Sorosky JI. Endometrial cancer. Obstet Gynecol 2008; 111: 436-47.

 2. Wojciechowska U, Didkowska J, Zatoński W. Corpus uteri cancer. In: Cancer in Poland in 2006. Department of Epidemiology and Cancer Prevention. Zatoński W (ed.). Warszawa: 2008; 30-2.

 3. Wood RD, Mitchell M, Sgouros J, et al. Human DNA repair genes. Science 2001; 291: 1284-9.

 4. Sreeja L, Syamala VS, Syamala V, et al. Prognostic importance of DNA repair gene polymorphisms of XRCC1 Arg399Gln and XPD Lys751Gln in lung cancer patients from India. J Cancer Res Clin Oncol 2008; 134: 645-52.

 5. Dufloth RM, Arruda A, Heinrich JK, et al. The investigation of DNA repair polymorphisms with histopathological characteristics and hormone receptors in a group of Brazilian women with breast cancer. Genet Mol Res 2008; 7: 574-82.

 6. Yen CY, Liu SY, Chen CH, et al. Combinational polymorphisms of four DNA repair genes XRCC1, XRCC2, XRCC3, and XRCC4 and their association with oral cancer in Taiwan. J Oral Pathol Med 2008; 37: 271-7.

 7. Sobczuk A, Smolarz B, Romanowicz-Makowska H i wsp. Polimorfizm Ser326Cys genu hOGG1 u chorych na raka piersi w wieku pomenopauzalnym z regionu łódzkiego. Przegląd Menopauzalny 2009; 2: 90-3.

 8. Okasaka T, Matsuo K, Suzuki T, et al. hOGG1 Ser326Cys polymorphism and risk of lung cancer by histological type. J Hum Genet 2009; 54: 739-45.

 9. Canbay E, Agachan B, Gulluoglu M, et al. Possible associations of APE1 polymorphism with susceptibility and HOGG1 polymorphism with prognosis in gastric cancer. Anticancer Res 2010; 30: 1359-64.

10. Pawlowska E, Janik-Papis K, Rydzanicz M, et al. The Cys326 allele of the 8-oxoguanine DNA N-glycosylase 1 gene as a risk factor in smoking- and drinking-associated larynx cancer. Tohoku J Exp Med 2009; 219: 269-75.

11. Yuan W, Xu L, Feng Y, et al. The hOGG1 Ser326Cys polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis. Breast Cancer Res Treat 2010; 122: 835-42.

12. Yang Y, Tian H, Zhang ZJ. Association of the XRCC1 and hOGG1 polymorphisms with the risk of laryngeal carcinoma. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2008; 25: 211-3.

13. Burri RJ, Stock RG, Cesaretti JA, et al. Association of single nucleotide polymorphisms in SOD2, XRCC1 and XRCC3 with susceptibility for the development of adverse effects resulting from radiotherapy for prostate cancer. Radiat Res 2008; 170: 49-59.

14. McWilliams RR, Bamlet WR, Cunningham JM, et al. Polymorphisms in DNA repair genes, smoking, and pancreatic adenocarcinoma risk. Cancer Res 2008; 68: 4928-35.

15. Wang Z, Xu B, Lin D, et al. XRCC1 polymorphisms and severe toxicity in lung cancer patients treated with cisplatin-based chemotherapy in Chinese population. Lung Cancer 2008; 62: 99-104.

16. Sreeja L, Syamala VS, Syamala V, et al. Prognostic importance of DNA repair gene polymorphisms of XRCC1 Arg399Gln and XPD Lys751Gln in lung cancer patients from India. J Cancer Res Clin Oncol 2008; 134: 645-52.

17. Dufloth RM, Arruda A, Heinrich JK, et al. The investigation of DNA repair

polymorphisms with histopathological characteristics and hormone receptors in a group of Brazilian women with breast cancer. Genet Mol Res 2008; 7: 574-82.

18. Yen CY, Liu SY, Chen CH, et al. Combinational polymorphisms of four DNA repair genes XRCC1, XRCC2, XRCC3, and XRCC4 and their association with oral cancer in Taiwan. J Oral Pathol Med 2008; 37: 271-7.

19. Shen M, Hung RJ, Brennan P, et al. Polymorphisms of the DNA repair genes XRCC1, XRCC3, XPD, interaction with environmental exposures, and bladder cancer risk in a case-control study in northern Italy. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12: 1234-40.

20. De Ruyck K, Wilding CS, Van Eijkeren M, et al. Microsatellite polymorphisms in DNA repair genes XRCC1, XRCC3 and XRCC5 in patients with gynecological tumors: association with late clinical radiosensitivity and cancer incidence. Radiat Res 2005; 164: 237-44.

21. De Ruyck K, Van Eijkeren M, Claes K, et al. Radiation-induced damage to normal tissues after radiotherapy in patients treated for gynecologic tumors: association with single nucleotide polymorphisms in XRCC1, XRCC3, and OGG1 genes and in vitro chromosomal radiosensitivity in lymphocytes. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 62: 1140-9.

22. Krupa R, Sobczuk A, Popławski T, et al. DNA damage and repair in endometrial cancer in correlation with the hOGG1 and RAD51 genes polymorphism. Mol Biol Rep 2010 [Epub ahead of print].

23. Divine KK, Gilliland FD, Crowell RE, et al. The XRCC1 399 glutamine allele is a risk factor for adenocarcinoma of the lung. Mutat Res 2001; 461: 273-8.

24. Zhou W, Liu G, Miller DP, et al. Polymorphisms in the DNA repair genes

XRCC1 and ERCC2, smoking, and lung cancer risk. Cancer Epidemiol

Biomarkers Prev 2003; 12: 359-65.

25. Kowalski M, Przybylowska K, Rusin P, et al. Genetic polymorphisms in DNA base excision repair gene XRCC1 and the risk of squamous cell carcinoma of the head and neck. J Exp Clin Cancer Res 2009; 28: 37.

26. Shen H, Xu Y, Qian Y, et al. Polymorphisms of the DNA repair gene XRCC1 and risk of gastric cancer in a Chinese population. Int J Cancer 2000; 88: 601-6.

27. Stern MC, Umbach DM, van Gils CH, et al. DNA repair gene XRCC1 polymorphisms, smoking, and bladder cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2001; 10: 125-31.

28. Lee SG, Kim B, Choi J, et al. Genetic polymorphisms of XRCC1 and risk of gastric cancer. Cancer Lett 2002; 187: 53-60.

29. Nelson HH, Kelsey KT, Mott LA, et al. The XRCC1 Arg399Gln polymorphism, sunburn, and non-melanoma skin cancer: evidence of gene-environment interaction. Cancer Res 2002; 62: 152-5.

30. Smith TR, Miller MS, Lohman K, et al. Polymorphisms of XRCC1 and XRCC3 genes and susceptibility to breast cancer. Cancer Lett 2003; 190: 183-90.

31. Figueiredo JC, Knight JA, Briollais L, et al. Polymorphisms XRCC1-R399Q and XRCC3-T241M and the risk of breast cancer at the Ontario site of the Breast Cancer Family Registry. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13: 583-91.

32. Han J, Hankinson SE, Ranu H, et al. Polymorphisms in DNA double-strand break repair genes and breast cancer risk in the Nurses’ Health Study. Carcinogenesis 2004; 25: 189-95.

33. Han J, Hankinson SE, Zhang SM, et al. Interaction between genetic variations in DNA repair genes and plasma folate on breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004; 13: 520-4.