eISSN: 2299-0038
ISSN: 1643-8876
Menopause Review/Przegląd Menopauzalny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Special Issues Editorial board Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors Publication charge Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank


1/2012
vol. 11
 
Share:
Share:
Original paper

Association between single nucleotide polymorphisms of the DNA mismatch repair gene hMSH2 and postmenopausal breast cancer in Polish women

Dariusz Samulak
,
Hanna Romanowicz-Makowska
,
Beata Smolarz
,
Ireneusz Połać
,
Marek Zadrożny
,
Bogusław Westfal
,
Stanisław Sporny

Przegląd Menopauzalny 2012; 1: 9–13
Online publish date: 2012/02/29
Article file
- 03 Romanowicz.pdf  [0.25 MB]
Get citation
 
 

Wstęp



Rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet. Nowotwór ten jest wynikiem współdziałania różnorodnych czynników – zarówno genetycznych, jak i środowiskowych [1–3].

Zmiany mutacyjne w obrębie genomu (translokacje, delecje i duplikacje) są częste w komórkach rakowych – szczególnie dotyczy to raka piersi [4]. Ich nagromadzenie jest wynikiem błędów w jednym z pięciu mechanizmów naprawy kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). Należą do nich: szlak naprawy przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia, wycinanie zasad azotowych, wycinanie nukleotydów, naprawa błędnie sparowanych zasad azotowych (mismatch repair – MMR), naprawa przez rekombinację.

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych usuwa głównie błędy powstałe w trakcie replikacji DNA i niewłaściwe pary zasad tworzące się w wyniku rekombinacji DNA oraz spontanicznej lub indukowanej deaminacji, utleniania bądź metylacji zasad azotowych [5].

System ten naprawia więc niektóre błędne sparowania zasad azotowych zmodyfikowanych przez czynniki chemiczne, np. O6-metyloguaniny, adduktów epoksydowej pochodnej benzo[a]pirenu i 8-oksoguaniny. System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych odgrywa ważną rolę w utrzymywaniu stabilności genomu, stąd jego defekty prowadzą do poważnych schorzeń, np. dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego i innych nowotworów, w tym raka piersi [6, 7].

Główna ścieżka działania MMR rozpoczyna się od rozpoznania miejsca błędnego sparowania przez heterodimer obejmujący białka MSH2 i MSH6 (kompleks MutSα) [8].

Drugą ścieżką systemu MMR jest inicjacja naprawy przez kompleks MutSβ, obejmujący białka MSH2 i MSH3, odpowiedzialny za rozpoznawanie mutacji typu insercja/delecja [8].

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych jest wysoce konserwatywnym mechanizmem naprawy DNA, który hamuje rekombinację homologiczną [9]. Błędy w systemie MMR prowadzą do wysokiego stopnia niestabilności mikrosatelitarnej. Wraz z utratą heterozygotyczności jest on wykrywany w 83% raków piersi [10, 11], co wskazuje na istotną rolę MMR w rozwoju tego nowotworu.

Główne białko MSH2 uczestniczące w rozpoznawaniu błędnie sparowanych zasad kodowane jest przez gen hMSH2 [12]. Jest to gen polimorficzny [13] i wobec istotnego znaczenia MSH2 w rozwoju nowotworów ważne wydaje się poznanie roli polimorfizmów w rozwoju raka piersi.

Ze względu na postęp w badaniach genetycznych, jaki dokonał się na przestrzeni ostatnich kilku lat, w prezentowanej pracy badano dwa polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (single nucleotide polymorphism – SNP) w obrębie genu hMSH2 – Gly322Asp i Asn127Ser u polskich kobiet chorych na raka piersi przy zastosowaniu techniki reakcji łańcuchowej polimerazy wykorzystującej enzymy restrykcyjne (polimerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism – PCR-RFLP).

Materiały i metody



Pacjentki

Krew została uzyskana od 205 kobiet w wieku pomenopauzalnym chorych na raka piersi bez przerzutów (n = 155) i z przerzutami do okolicznych węzłów chłonnych (n = 50) leczonych w Klinice Chirurgii Onkologicznej i Chorób Piersi Instytutu Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. Pacjentki były w wieku 48–82 lat (średnia wieku 58 lat). Średni rozmiar guza wynosił 20 mm (17–32 mm). Wszystkie nowotwory były klasyfikowane wg skali Scarf-Bloom-Richardson. Nowotworów I stopnia stwierdzono 48 (23%), II stopnia – 122 (60%), a III stopnia – 35 (17%). Jako grupę kontrolną zastosowano krew osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej (n = 180). Kwas deoksyrybonukleinowy do badań izolowany był z zastosowaniem zestawu QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta.

Analiza polimorfizmów genu hMSH2

Analiza polimorfizmu hMSH2 Asn127Ser została przeprowadzona metodą PCR-RFLP [14]. Polimorfizm Gly322Asp został określony z zastosowaniem starterów 5’-GTTTTCACTAATGAGCTTGC-3’ i 5’-AGTGGTATAATCATGTGGGT-3’. Reakcja łańcuchowej polimerazy została przeprowadzona w termocyklerze GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems). Mieszanina reakcyjna obejmowała 100 ng DNA, 12,5 pmol starterów, 0,2 mmol/l dNTPs, 2 mmol/l MgCl2 i 1 U polimerazy Taq DNA. Warunki PCR były następujące 95°C przez 60 s, 63°C przez 30 s i 72°C przez 40 s, przez 30 cykli. Produkt o długości 252 pz był trawiony 5 U enzymu restrykcyjnego HinfI w temperaturze 37ºC. Allel dziki Gly charakteryzowało pasmo długości 252 pz, allel zmutowany Asp reprezentowały dwa pasma: 70 i 182 pz.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna rozkładu genotypów oraz alleli w grupie badanej i kontrolnej przeprowadzona została po wcześniejszym potwierdzeniu, że otrzymane układy pozostają w stanie równowagi wg reguły Hardy’ego-Weinberga. Analizowano rozkłady genotypów i alleli oraz oceniono ich zgodność z rozkładem Hardy’ego-Weinberga przy użyciu testu χ2. Różnice pomiędzy rozkładami w poszczególnych grupach oceniano, także stosując test χ2. Wynik uznawano za istotny statystycznie przy poziomie istotności p < 0,05.

Ocenę genotypów i alleli pod względem ich związku z daną cechą, np. ryzykiem wystąpienia raka, przeprowadzano przez zastosowanie analizy ilorazu szans (odds ratio – OR) oraz 95-procentowego przedziału ufności (95 percent confindence interval – 95% CI), które obliczano wg modelu regresji logistycznej. Korzystano z pakietu Statistica v. 7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA).

Wyniki



W tabeli I przedstawiono rozkład genotypów i częstości alleli Gay i Asp polimorfizmu Gly322Asp genu hMSH2 w grupie chorych na raka piersi i w grupie kontrolnej. Stwierdzono statystycznie znaczące różnice pomiędzy badanymi grupami (p < 0,05). Częstość alleli Gly i Asp w grupie chorych wynosiła 0,65/0,35, natomiast w grupie kontrolnej 0,73/0,27. U pacjentek częstości genotypów Gly/Gly, Gly/Asp i Asp/Asp różniły się znacząco (p < 0,05) od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga. Homozygota Asp/Asp zwiększała około dwukrotnie ryzyko wystąpienia raka piersi [OR 2,60 (95% CI 1,03–6,53); p = 0,043].

Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów i częstości alleli Asn i Ser polimorfizmu Asn127Ser genu hMSH2 pomiędzy grupą badaną a kontrolną (tab. II). Kobiety chore na raka piersi wykazywały następującą częstość genotypów: Asn/Asn – 64%, Asn/Ser – 29% i Ser/Ser – 7%, podczas gdy grupa kontrolna Asn/Asn – 72%, Asn/Ser – 22% i Ser/Ser – 6%.

Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów i częstości alleli obu badanych polimorfizmów genu hMSH2 w grupach o różnym stopniu zaawansowania raka piersi wg skali Scarf-Bloom-Richardson (tab. III i IV).

Dyskusja



Wiele czynników środowiskowych, jak promieniowanie radiacyjne, dieta, endogenne i egzogenne estrogeny, mogą być związane z ryzykiem rozwoju raka piersi. Ostatnie badania sugerują, że polimorficzne warianty genów naprawy DNA mogą wpływać na zdolności do rozwoju nowotworów [15].

System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych stoi na straży integralności genomu [16]. Kluczowymi białkami tego systemu są: MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2. Kompleks: MutSα rozpoznaje błędne sparowanie zasada–zasada i pętlę powstałą w wyniku mutacji typu insercja/delecja, kompleks MutSβ rozpoznaje tylko drugi typ uszkodzenia [17, 18].

Utrata prawidłowej funkcji MMR powoduje niestabilność mikrosatelitarną (microsatellite instability – MSI) – typ niestabilności genomowej polegającej na zmianach w długości sekwencji mikrosatelitarnych [19]. Sekwencje mikrosatelitarne są to proste, tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami. Najczęściej są to jednak dwunukleotydowe motywy powtórzeń.

Wysoki poziom uszkodzeń DNA i wady w MMR mogą predysponować do rozwoju raka [20]. W raku piersi bardzo często dochodzi do defektów w MMR [21]. Niestabilność mikrosatelitarna i utrata heterozygotyczności (loss of heterozygosity – LOH) są wykrywane w ponad 80% raków piersi, co sugeruje potencjalną rolę MMR w rozwoju tego nowotworu [11].

Polimorfizm SNP w genach naprawy DNA może wpływać na ryzyko rozwoju raka w wyniku ich związku z utrzymaniem integralności genomu [22]. Wiele genetycznych zmian w formie SNP stwierdza się w genach MMR, ale ich funkcja nie jest jeszcze poznana. Zmiany w tych genach mogą wywierać różny wpływ na fenotyp nowotworów w zależności od umiejscowienia zmiany.

Istotne genetyczne zmiany występują w genach MMR w raku jelita grubego [23–25], niewiele natomiast wiadomo o ich roli w raku piersi. Analiza SNP w raku piersi wykazała dwa istniejące związki: polimorfizmy MSH3 Ala1045Thr/MSH6 Gly39Glu zmniejszały ryzyko raka, polimorfizmy MSH4 Ala97Thr/MLH3 Leu844Pro zwiększały ryzyko raka piersi [26].

Wykryto kilka wariantów polimorficznych w genie hMSH2 [13], ale dane na temat ich znaczenia w raku piersi są nieliczne.

W Polsce Popławski i wsp. [14] wykazali brak korelacji pomiędzy polimorfizmem A→G w pozycji 127 genu hMSH2 powodującym podstawienie Asn→Ser w kodonie 127 (polimorfizm Asn127Ser), polimorfizmem G→A w pozycji 1032 powodującym podstawienie Gly→Asp w kodonie 322 (polimorfizm Gly322Asp), a progresją raka piersi [14]. Natomiast wykryto silny związek pomiędzy wystąpieniem raka piersi a homozygotą Gly/Gly.

W prezentowanej pracy badano dwa polimorfizmy genu hMSH2 (Gly322Asp i Asn127Ser) i ich związek z rakiem piersi u polskich kobiet. Polimorfizmy wybrane do badań mogą mieć funkcjonalne znaczenie i odpowiadać za defekty w zdolności MMR do naprawy DNA.

W pracy żaden z genotypów polimorfizmu Asn127Ser nie wpływał na ryzyko raka piersi. Nie było statystycznie istotnych różnic w rozkładzie genotypów i częstości alleli pomiędzy pacjentkami i grupą kontrolną. Różnice takie wykryto jednak w przypadku drugiego badanego polimorfizmu Gly322Asp genu hMSH2. Rozkład genotypów Asp/Asp, Asp/Gly i Gly/Gly w grupie chorych różnił się od rozkładu zgodnego z prawem Hardy’ego-Weinberga z przewagą homozygoty Asp/Asp. Homozygota Asp/Asp zwiększała około dwukrotnie ryzyko wystąpienia raka piersi.

Wnioski



Istnieje możliwość, że allel Asp pozostaje w związku z innymi, niewykrytymi jeszcze mutacjami zlokalizowanymi poza regionem kodującym genu hMSH2, które mogą być istotne dla stężenia białka MSH2 tworzącego kompleksy umożliwiające usuwanie błędów w ramach MMR.

Badania sugerują, że polimorfizm Gly322Asp genu hMSH2 może być związany z rakiem piersi u polskich kobiet, jednakże badania obejmujące większą grupę badaną są konieczne do potwierdzenia tego wniosku.

Piśmiennictwo



1. Vargo-Gogola T, Rosen JM. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer 2007; 7: 659-72.

2. Dapic V, Carvalho MA, Monteiro AN. Breast cancer susceptibility and the DNA damage response. Cancer Control 2005; 12: 127-36.

3. Veronesi U, Boyle P, Goldhirsch A, et al. Breast cancer. Lancet 2005; 365: 1727-41.

4. Davidson JM, Gorringe KL, Chin SF, et al. Molecular cytogenetic analysis of breast cancer cell lines. Br J Cancer 2000; 83: 1309-17.

5. Skinner AM, Turker MS. Oxidative mutagenesis, mismatch repair, and aging. Sci Aging Knowledge Environ 2005; 2005: re3.

6. Karran P. Microsatellite instability and DNA mismatch repair in human cancer. Semin Cancer Biol 1996; 7: 15-24.

7. Neri S, Gardini A, Facchini A, et al. Mismatch repair system and aging: microsatellite instability in peripheral blood cells from differently aged participants. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2005; 60: 285-92.

8. Hsieh P, Yamane K. DNA mismatch repair: molecular mechanism, cancer, and ageing. Mech Ageing Dev 2008; 129: 391-407.

9. Li GM. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res 2008; 18: 85-98.

10. Kuligina ESh, Grigoriev MY, Suspitsin EN, et al. Microsatellite instability analysis of bilateral breast tumors suggests treatment-related origin of some contralateral malignancies. J Cancer Res Clin Oncol 2007; 133: 57-64.

11. Moinfar F, Beham A, Friedrich G, et al. Macro-environment of breast carcinoma: frequent genetic alterations in the normal appearing skins of patients with breast cancer. Mod Pathol 2008; 21: 639-46.

12. Murata H, Khattar NH, Kang Y, et al. Genetic and epigenetic modification of mismatch repair genes hMSH2 and hMLH1 in sporadic breast cancer with microsatellite instability. Oncogene 2002; 21: 5696-703.

13. Wong EM, Tesoriero AA, Pupo GM, et al. Is MSH2 a breast cancer susceptibility gene? Fam Cancer 2008; 7: 151-5.

14. Poplawski T, Zadrozny M, Kolacinska A, et al. Polymorphisms of the DNA mismatch repair gene HMSH2 in breast cancer occurence and progression. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: 199-204.

15. Jiricny J, Nyström-Lahti M. Mismatch repair defects in cancer. Curr Opin Genet Dev 2000; 10: 157-61.

16. Schofield MJ, Hsieh P. DNA mismatch repair: molecular mechanisms and biological function. Annu Rev Microbiol 2003; 57: 579-608.

17. Harfe BD, Minesinger BK, Jinks-Robertson S. Discrete in vivo roles for the MutL homologs Mlh2p and Mlh3p in the removal of frameshift intermediates in budding yeast. Curr Biol 2000; 10: 145-8.

18. Stojic L, Brun R, Jiricny J. Mismatch repair and DNA damage signalling. DNA Repair (Amst) 2004; 3: 1091-101.

19. de la Chapelle A. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat Rev Cancer 2004; 4: 769-80.

20. Moses RE. DNA damage processing defects and disease. Annu Rev Genomics Hum Genet 2001; 2: 41-68.

21. Romanowicz H, Smolarz B, Fiks T i wsp. Znaczenie mechanizmu naprawy DNA błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR) w raku piersi. Przegl Menopauz 2010; 2: 95-100.

22. Ford BN, Ruttan CC, Kyle VL, et al. Identification of single nucleotide polymorphisms in human DNA repair genes. Carcinogenesis 2000; 21: 1977-81.

23. Salovaara R, Loukola A, Kristo P, et al. Population-based molecular detection of hereditary nonpolyposis colorectal cancer. J Clin Oncol 2000; 18: 2193-200.

24. Giardiello FM, Brensinger JD, Petersen GM. AGA technical review on hereditary colorectal cancer and genetic testing. Gastroenterology 2001; 121: 198-213.

25. Hampel H, Frankel WL, Martin E, et al. Screening for the Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal cancer). N Engl J Med 2005; 352: 1851-60.

26. Conde J, Silva SN, Azevedo AP, et al. Association of common variants in mismatch repair genes and breast cancer susceptibility: a multigene study. BMC Cancer 2009; 9: 344.
Copyright: © 2012 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.