eISSN: 2299-0038
ISSN: 1643-8876
Menopause Review/Przegląd Menopauzalny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Special Issues Editorial board Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors Publication charge Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank


3/2012
vol. 11
 
Share:
Share:
Original paper

Diagnostic value of glucose transporter 1 and 3 (GLUT1 and GLUT3) mRNA level in postmenopausal women with urinary bladder cancer

Anna Krześlak
,
Paweł Jóźwiak
,
Ewa Forma
,
Magdalena Bryś
,
Paweł Woźniak
,
Jacek Wikosz
,
Marek Lipiński
,
Waldemar Różański

Przegląd Menopauzalny 2012; 3: 178–182
Online publish date: 2012/07/04
Article file
- 04 Rozanski.pdf  [0.58 MB]
Get citation
 
 

Wstęp

Rak pęcherza moczowego w Polsce jest 8. pod względem częstości zachorowań nowotworem u kobiet i stanowi jedno z poważniejszych wyzwań dla urologów oraz onkologów. Nowotwór ten występuje w postaci nienaciekającej mięśniówkę właściwą w ok. 70% przypadków i inwazyjnej w ok. 30%. Raki nieinwazyjne cechuje tendencja do dawania wznowy w ok. 60% przypadków. Od 10% do 30% wśród guzów nawrotowych wykazuje istotną progresję w zakresie utraty różnicowania komórkowego i stopnia zaawansowania klinicznego [1]. Zgodnie z danymi eksperymentalnymi, w molekularne podłoże transformacji nowotworowej tego narządu zaangażowane mogą być także czynniki białkowe uczestniczące w transmisji sygnału komórkowego, stymulowane przez estrogeny [2, 3]. U kobiet w wieku przedmenopauzalnym estrogeny syntetyzowane są głównie przez jajniki, natomiast u kobiet w wieku pomenopauzalnym miejsce syntezy tych hormonów przejmuje tkanka tłuszczowa, mózg, śródbłonek naczyń krwionośnych i mięśnie gładkie [4]. Z uwagi na to, że nowotwory pęcherza moczowego występują głównie u kobiet w podeszłym wieku, celowa wydaje się analiza molekularnych podstaw transformacji nowotworowej tego narządu w tej właśnie grupie kobiet.

Cechą charakterystyczną metabolizmu komórek nowotworowych jest nasilenie procesu glikolizy, które możliwe jest m.in. dzięki zwiększonemu transportowi glukozy do komórki [5]. Różnice w szybkości i ilości wychwytywania glukozy pomiędzy komórkami normalnymi i nowotworowymi stały się podstawą opracowania metody diagnozowania nowotworów przez zastosowanie pozytonowej tomografii emisyjnej wykorzystującej fluorodeoksyglukozę zawierającą promieniotwórczy izotop 18F jako znacznik [6]. Przechodzenie glukozy przez błonę komórkową odbywa się z udziałem białek należących do rodziny transporterów glukozy określanych jako GLUT. Do chwili obecnej zidentyfikowano 14 białek (GLUT1–GLUT14) należących do tej rodziny i zaangażowanych w transport glukozy oraz innych heksoz [7]. Poszczególne transportery wykazują różne powinowactwo do transportowanych monosacharydów oraz różnią się ekspresją tkankową [5]. GLUT1 i GLUT3 należą do transporterów o dużym powinowactwie do glukozy, umożliwiających bardzo szybki transport glukozy do komórek. GLUT1 ulega ekspresji na zróżnicowanym poziomie w wielu typach komórek i uważa się, że odpowiada on za podstawowy transport glukozy [5]. Występowanie GLUT3 jest bardziej ograniczone. Stanowi on główny transporter glukozy w neuronach, ale był również identyfikowany w spermie i krwinkach białych [8].

Stwierdzono, że w komórkach nowotworowych, w następstwie zwiększonego zapotrzebowania na glukozę, dochodzi do nasilenia ekspresji niektórych transporterów glukozy. GLUT1 jest transporterem glukozy, którego nad-

ekspresję obserwuje się w przypadku prawie wszystkich nowotworów złośliwych. Zwiększoną ekspresję GLUT1 w stosunku do tkanek prawidłowych stwierdzono w przypadku raka wątroby [9], trzustki [9], nerek [10], płuc [11], piersi [12], żołądka [13], nowotworów głowy i szyi [14] oraz tarczycy [15]. GLUT3 ulega nadekspresji w rakach płuc,

jajnika i żołądka [16].

Cel pracy

Celem badań była ocena ekspresji transporterów glukozy GLUT1 i GLUT3, na poziomie mRNA, metodą łańcuchowej reakcji polimeryzacji w czasie rzeczywistym (real-time polymerase chain reaction – real-time PCR) oraz ocena przydatności diagnostycznej badanych genów jako markerów transformacji nowotworowej pęcherza moczowego kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Materiał i metody

Materiał do badań stanowiły preparaty moczu pobranego od 46 kobiet ze zdiagnozowanym rakiem pęcherza moczowego. Średnia wieku w tej grupie wynosiła 56,7 ±12,4 roku. Charakterystyka kliniczno-patologiczna preparatów zamieszczona została w tabeli I. Materiał kontrolny stanowiły preparaty moczu pobranego od 37 kobiet, u których w badaniu ultrasonograficznym nie zdiagnozowano zmian nowotworowych. U żadnej z kobiet, zarówno w grupie chorych, jak i kontrolnej, nie stwierdzono cukrzycy. Złuszczone komórki nabłonkowe izolowano z 30–50 ml moczu. Bezpośrednio po pobraniu próby moczu przechowywano w temperaturze 4oC do chwili wykonywania oznaczeń, a następnie wirowano przy 2000 rpm przez 15 min. Otrzymany osad przemywano dwukrotnie zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (pH 7,6) i przechowywano w temperaturze –80oC do dalszych oznaczeń.



Izolowanie RNA i synteza cDNA



Całkowite RNA izolowano przy użyciu odczynnika TRI Reagent (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Przyjętym kryterium czystości DNA była wartość A260/A280 mieszcząca się w granicach 1,8–2,0. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano przy użyciu zestawu PCR Kit ver. 3.0 (Takara Bio Inc., Japonia) zgodnie z zaleceniami producenta. cDNA przechowywano w temperaturze –20°C.



Analiza ilościowa produktu amplifikacji w czasie rzeczywistym – reakcja real-time PCR



Otrzymany RNA stanowił matrycę w reakcji real-time PCR dla oznaczenia liczby kopii mRNA dla genu GLUT1 i GLUT3. Użyta mieszanina reakcyjna zawierała: 0,5 µl cDNA, 5 µl TaqMan® Universal PCR MasterMix, 0,5 µl 20× TaqMan® Gene Expression Assays i 4 μl H2O. Reakcję real-

time PCR prowadzono w urządzeniu Mastercycler®ep

realplex (Eppendorf). Początkowa ilość matrycy wyznaczana była na podstawie parametru Ct (teoretyczny numer cyklu, przy którym wartość fluorescencji jest wyższa niż przyjęta arbitralnie wartość graniczna). Pomiar wartości Ct wykonano w dwóch powtórzeniach, jako gen referencyjny wykorzystano GAPDH. Do badań zastosowano następujące sondy TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA): GLUT1 – Hs00892681_m1; GLUT3 – Hs00359840_m1, GAPDH – Hs00266705_g1.



Analiza statystyczna



Analizy statystycznej wyników dokonano przy użyciu programu komputerowego STATISTICA wersja 9.0 (StatSoft, Poland). Do oceny rozkładów wykorzystano test Kołmogorowa-Smirnowa i po stwierdzeniu rozkładów odmiennych od normalnych do dalszych obliczeń stosowano testy nieparametryczne – U Manna-Whitneya i Kruskala-Wallisa.

Wyniki

Ekspresję genu GLUT1 stwierdzono w 37/46 (82%) preparatach moczu pobranego od kobiet chorych oraz w 27/37 (74%) preparatach moczu pozyskanego od kobiet zdrowych. Ekspresji GLUT3 nie stwierdzono w moczu osób zdrowych, natomiast ekspresję tego genu wykazano w 28/46 (62%) próbach moczu pobranego od kobiet chorych. Zestawienie poziomu ekspresji genów GLUT1 i GLUT3 z cechami kliniczno-patologicznymi zawarto w tabeli II.

Wykazano, że ekspresja zarówno GLUT1, jak i GLUT3 była znamiennie statystycznie wyższa w preparatach moczu pozyskanych od chorych na raka wykazującego wyższy stopień zaawansowania klinicznego oraz niższy stopień zróżnicowania histologicznego, odpowiednio T2–T4 oraz G2 i G3, w porównaniu ze stadium Ta–T1 i G1. Nie wykazano natomiast znamiennej różnicy w ekspresji badanych genów w odniesieniu do występowania wznowy u pacjentek.

Dyskusja

Komórki nowotworowe charakteryzują się zwiększonym zapotrzebowaniem na glukozę. Wynika to głównie z faktu, że pozyskują one energię prawie wyłącznie w procesie mało efektywnej glikolizy beztlenowej, która jest sposobem adaptacji tych komórek do warunków hipoksji towarzyszącej rosnącym guzom. Ważnym regulatorem procesów związanych z hipoksją jest czynnik HIF-1α (hypoxia inducible factor 1α). Czynnik ten wpływa na regulację ekspresji wielu genów, m.in. tych zaangażowanych w angiogenezę, transport glukozy i wewnątrzkomórkowy metabolizm [17]. Ekspresja GLUT1 i GLUT3 jest stymulowana przez HIF-1α w warunkach niedoboru tlenu. Z kolei na ekspresję i aktywność HIF-1α wpływa szereg czynników, np. estrogeny. W komórkach raka jajnika estrogeny i progesteron regulują ekspresję HIF-1α poprzez szlak sygnałowy z udziałem kinazy Akt, wpływając na potencjał metastatyczny komórek [18]. Hipoksja związana jest z agresywnym zachowaniem guzów i dlatego wydaje się, że nadekspresja GLUT1 i GLUT3 może odgrywać rolę w progresji nowotworów. W przypadku kilku nowotworów, np. głowy i szyi, raka płuc, pęcherzyka żółciowego, jelita grubego, nerki, piersi i jajników, stwierdzono zależność pomiędzy ekspresją GLUT1 a stopniem zaawansowania oraz złymi rokowaniami dla pacjenta [17–22]. Ekspresja GLUT3 wzrasta także w komórkach raków w odpowiedzi na hipoksję, ale badania kliniczne dają niejednoznaczne wyniki.

Istnieje kilka doniesień dotyczących ekspresji GLUT1 w raku pęcherza moczowego [23–26]. Nie ma natomiast danych dotyczących ekspresji GLUT3. Wyniki badań immunohistochemicznych różnych preparatów nowotworów pęcherza moczowego wskazują na korelację pomiędzy wysoką ekspresją transportera GLUT1 a agresywnym potencjałem komórek nowotworowych, stopniem zaawansowania nowotworu, złymi rokowaniami i niskim wskaźnikiem przeżywalności [23–24].

W prezentowanej pracy analizowano ekspresję GLUT1 i GLUT3 w komórkach pochodzących z osadu moczu kobiet w wieku pomenopauzalnym ze zdiagnozowanymi nowotworami pęcherza moczowego oraz kobiet, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej, stanowiących grupę kontrolną. W przeciwieństwie do wcześniejszych immunohistochemicznych badań Changa i wsp. [23], które sugerowały brak ekspresji GLUT1 w normalnej śluzówce pęcherza, przeprowadzona przez autorów niniejszej pracy analiza wykazała ekspresję mRNA GLUT1 w większości przypadków, zarówno w grupie kobiet chorych, jak i w grupie kontrolnej. Stwierdzono jednak, że ekspresja GLUT1 w moczu kobiet chorych była prawie 4-krotnie wyższa niż w grupie kontrolnej. Ekspresję GLUT3 obserwowano w 62% przypadków chorych na raka pęcherza moczowego. Nie stwierdzono natomiast ekspresji tego transportera w osadzie komórek pochodzących z moczu kobiet z grupy kontrolnej. GLUT3 może być zatem dobrym markerem transformacji nowotworowej w przypadku pęcherza moczowego u kobiet w wieku pomenopauzalnym.

Stwierdzono istotne statystycznie różnice w ekspresji obu transporterów glukozy pomiędzy rakami nieinwazyjnymi (Ta–T1) a rakami inwazyjnymi (T2–T4). Ekspresja GLUT1 i GLUT3 koreluje również z uznanym markerem agresywności guzów, tj. stopniem złośliwości histologicznej. Większa ekspresja transporterów obserwowana była w moczu pacjentek z rakami średnio i słabo zróżnicowanymi (G2 i G3) niż u kobiet z nowotworami dobrze zróżnicowanymi o niskim stopniu złośliwości histologicznej (G1).

Uzyskane wyniki sugerują, że ekspresja GLUT1 i GLUT3 oznaczana w osadzie moczu może być ważnym czynnikiem diagnostycznym w przypadku raka pęcherza moczowego u kobiet. Sugerujemy, że wysoka ekspresja GLUT1 i GLUT3 w rakach pęcherza wskazuje na zwiększony transport i zużycie glukozy, co jest skorelowane z agresywnym charakterem nowotworu. Niezależnie od ich znaczenia w diagnostyce wydaje się, że GLUT1 i 3 mogą być również brane pod uwagę jako cel terapii raka pęcherza moczowego, ponieważ zmniejszenie transportu glukozy może ograniczać potencjał proliferacyjny i zdolność do inwazji komórek nowotworowych.



Praca wykonana z funduszy działalności statutowej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 503/0-157-01/503-01.

Praca wykonana z funduszy działalności statutowej Uniwersytetu Łódzkiego.


Piśmiennictwo

1. Kompier LC, van Tilborg AA, Zwarthoff EC. Bladder cancer: novel molecular characteristics, diagnostic, and therapeutic implications. Urol Oncol 2010; 28: 91-6.

2. Teng J, Wang ZY, Jarrard DF, Bjorling DE. Roles of estrogen receptor alpha and beta in modulating urothelial cell proliferation. Endocr Relat Cancer 2008; 15: 351-64.

3. Shen SS, Smith CL, Hsieh JT, et al. Expression of estrogen receptors-alpha and -beta in bladder cancer cell lines and human bladder tumor tissue. Cancer 2006; 106: 2610-6.

4. Davis SR, Burger HG. The role of androgen therapy. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2003; 17: 165-75.

5. Macheda ML, Rogers S, Best JD. Molecular and cellular regulation

of glucose transporter (GLUT) proteins in cancer. J Cell Physiol 2005; 202: 654-62.

6. Kresnik E, Gallowitsch HJ, Mikosch P, et al. Fluorine-18-fluorodeoxyglucose positron emission tomography in the preoperative assessment

of thyroid nodules in an endemic goiter area. Surgery 2003; 133: 294-9.

7. Thorens B, Mueckler M. Glucose transporters in the 21st Century. Am

J Physiol Endocrinol Metab 2010; 298: E141-5.

8. Simpson IA, Dwyer D, Malide D, et al. The facilitative glucose transporter GLUT3: 20 years of distinction. Am J Physiol Endocrinol Metab 2008; 295: E242-53.

9. Yamamoto T, Seino Y, Fukumoto H, et al. Over-expression of facilitative glucose transporter genes in human cancer. Biochem Biophys Res Commun 1990; 170: 223-30.

10. Nagase Y, Takata K, Moriyama N, et al. Immunohistochemical localization of glucose transporters in human renal cell carcinoma. J Urol 1995; 153: 798-801.

11. Ito T, Noguchi Y, Satoh S, et al. Expression of facilitative glucose transporter isoforms in lung carcinomas: its relation to histologic type, differentiation grade, and tumor stage. Mod Pathol 1998; 11: 437-43.

12. Brown RS, Wahl RL. Overexpression of Glut-1 glucose transporter in human breast cancer. An immunohistochemical study. Cancer 1993; 72: 2979-85.

13. Noguchi Y, Marat D, Saito A, et al. Expression of facilitative glucose transporters in gastric tumors. Hepatogastroenterology 1999; 46: 2683-9.

14. Mellanen P, Minn H, Grénman R, Härkönen P. Expression of glucose transporters in head-and-neck tumors. Int J Cancer 1994; 56: 622–9.

15. Matsuzu K, Segade F, Matsuzu U, et al. Differential expression of glucose transporters in normal and pathologic thyroid tissue. Thyroid 2004; 14: 806-12.

16. Younes M, Lechago LV, Somoano JR, et al. Immunohistochemical detection of Glut3 in human tumors and normal tissues. Anticancer Res 1997; 17: 2747-50.

17. Airley RE, Mobasheri A. Hypoxic regulation of glucose transport, anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer: novel pathways and targets for anticancer therapeutics. Chemotherapy 2007; 53: 233-56.

18. Hua K, Din J, Cao Q, et al. Estrogen and progestin regulate HIF-1alpha expression in ovarian cancer cell lines via the activation of Akt signaling transduction pathway. Oncol Rep 2009; 21: 893-8.

19. Younes M, Brown RW, Stephenson M, et al. Overexpression of Glut1 and Glut3 in stage I nonsmall cell lung carcinoma is associated with poor survival. Cancer 1997; 80: 1046-51.

20. Reisser C, Eichhorn K, Herold-Mende C, et al. Expression of facilitative glucose transport proteins during development of squamous cell carcinomas of the head and neck. Int J Cancer 1999; 80: 194-8.

21. Haber RS, Rathan A, Weiser KR, et al. GLUT1 glucose transporter expression in colorectal carcinoma: a marker for poor prognosis. Cancer 1998; 83: 34-40.

22. Lidgren A, Bergh A, Grankvist K, et al. Glucose transporter-1 expression in renal cell carcinoma and its correlation with hypoxia inducible factor-1 alpha. BJU Int 2008; 101: 480-4.

23. Ozbudak IH, Shilo K, Tavora F, et al. Glucose transporter-1 in pulmonary neuroendocrine carcinomas: expression and survival analysis. Mod Pathol 2009; 22: 633-8.

24. Chang S, Lee S, Lee C, Kim JI, Kim Y. Expression of the human erythrocyte glucose transporter in transitional cell carcinoma of the bladder. Urology 2000; 55: 448-52.

25. Younes M, Juarez D, Lechago LV, Lerner SP. Glut 1 expression in transitional cell carcinoma of the urinary bladder is associated with poor patient survival. Anticancer Res 2001; 21: 575-8.

26. Lee JH, Kim YW, Chang SG. Glucose transporter-1 expression in urothelial papilloma of the bladder. Urol Int 2005; 74: 268-71.

27. Palit V, Phillips RM, Puri R, et al. Expression of HIF-1alpha and Glut-1 in human bladder cancer. Oncol Rep 2005; 14: 909-13.
Copyright: © 2012 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.