Ocena wartości serodiagnostyki bakteriologicznej u chorych na niesklasyfikowane zapalenie stawów
Część III. Metoda immunoenzymatyczna (ELISA) jako test skriningowy w diagnostyce serologicznej zapaleń stawów o podejrzewanej etiologii B. burgdorferi; krzyżowa reaktywność przeciwciał dla B. burgdorferi z S. enteritidis, S. typhimurium, Y. enterocolitica O3 i Ch. trachomatis

Mimo że borelioza jest układową infekcyjną chorobą z różnorodnymi objawami klinicznymi [1], dla reumatologów jej rozpoznanie ma kluczową wartość z uwagi na skuteczność jej leczenia, w tym w większości przypadków przy zastosowaniu odpowiedniej antybiotykoterapii [2-4].
Czynnikiem etiologicznym są krętki Borrelia burgdorferi sensu lato, w skład którego wchodzą m.in. genogatunki patogenne: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii,
B. garinii. Uważa się, że te genogatunki są odpowiedzialne za 3 etapy boreliozy (choroby z Lyme):
1) etap wczesny z erythema chronicum migrans (EM), wywoływany głównie przez B. afzelii, występujący średnio po 4-6 tyg. od ukąszenia przez kleszcza,
2) etap drugi z klinicznymi objawami (po 1-12 mies. od ukąszenia) lymphocytic meningoradiculitis, neuroboreliosis (odpowiedzialny B. garinii),
3) etap trzeci głównie z objawami: chronic progressive encephalomyelitis, acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) i chronic arthritis, występującymi po kilku miesiącach do kilku lat (odpowiedzialny zwłaszcza B. burgdorferi sensu stricto).
Wczesna diagnostyka [5-7] tej choroby ma więc ogromne znaczenie i jest oparta głównie na:
• objawach klinicznych,
• wywiadzie epidemiologicznym,
• wynikach testów laboratoryjnych.
Metody stosowane w diagnostyce laboratoryjnej boreliozy dzielą się na bezpośrednie, wykonywane w wyspecjalizowanych placówkach, które mogą hodować krętki
B. burgdorferi z tkanek i płynów ustrojowych [8, 9], stosować mikroskopie w ciemnym polu widzenia (cpw) i/lub metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction - PCR) [10, 11]. Metodami pośrednimi można wykrywać swoiste przeciwciała klasy IgG i IgM w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym, najlepiej dwustopniowo, tj. testem skriningowym ilościowym (ELISA, IFT) [12-17], zawierającym antygeny rekombinowane, oraz jakościowym - potwierdzającym, tj. Western-blot z poszczególnymi frakcjami antygenów rekombinowanych [18, 19].
Celem pracy była ocena testu skriningowego ELISA w wykrywaniu przeciwciał surowiczych dla B. burgdorferi oraz analiza retrospektywna dotycząca krzyżowej reaktywności przeciwciał z innymi badanymi antygenami drobnoustrojów ewentualnie odpowiedzialnych za niesklasyfikowane zapalenia stawów. Dotyczyło to Yersinia enterocolitica O3, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium oraz Chlamydia trachomatis, drobnoustrojów, którymi najczęściej krajowi reumatolodzy są zainteresowani w różnicowaniu odczynowych zapaleń stawów.

Materiał i metody
Materiał do badań na obecność przeciwciał dla
B. burgdorferi stanowiło 1918 surowic uzyskanych od 1850 osób. Pochodziły one od pacjentów zarówno hospitalizowanych w Instytucie Reumatologii, konsultowanych w Poliklinikach Instytutu Reumatologii i konsultowanych w innych placówkach medycznych (głównie Carolina Medical Center) oraz od osób prywatnych i - częściowo - pracowników Instytutu Reumatologii. Szczegółowe dane przedstawiono na rycinie 1. Okres retrospektywnych analiz dotyczył lat 2004-2006.
Obecność przeciwciał oznaczano metodą ELISA, przy użyciu testu firmy Biomedica. W zasadzie przeciwciała dotyczyły B. burgdorferi sensu lato, dołki mikropłytki opłaszczone były bowiem następującymi antygenami rekombinowanymi, w przypadku oznaczania przeciwciał klasy IgM: OspC (p 21) - zewnętrzne białka powierzchniowe genogatunków - B. afzelii oraz B. garinii, VLSE - białko fuzyjne różnych genogatunków, p 41 - wewnętrzny fragment flagelliny B. garinii.
W przypadku oznaczania przeciwciał klasy IgG antygenami rekombinowanymi opłaszczającymi dołki mikropłytki były: OspC - j.w., p 18 (B. afzelii), p 100 (B. afzelii) oraz VLSE j.w.
Przeciwciała oznaczano w dwóch klasach ilościowo, gdzie absorbancja standardu cut off odzwierciedla wartość 10 BBU/ml (Biomedica Borrelia Units), co jest podstawą obliczenia wyników: OD próbki badanej/OD kontroli cut off × 10 = BBU/ml.
Za wynik mało dodatni uważa się próbki surowicy o wartościach 11-20 BBU/ml, wysoko dodatni
21-30 BBU/ml, a bardzo wysoko dodatni > 30 BBU/ml. Próbki o wartości 9-11 BBU/ml uważano za wynik wątpliwy, sugerujący powtórzenie badania z nowo pobraną próbką surowicy.

Wyniki
Na rycinie 1 przedstawiono szczegółowo liczbę (odsetki) badań zlecanych przez poszczególne Kliniki i Polikliniki Instytutu Reumatologii, inne placówki medyczne oraz osoby prywatne i próby diagnostyczne wykorzystane do celów naukowych. Z danych tych wynika,
że zdecydowanie najczęściej, zarówno w poszczególnych latach, jak i w całym analizowanym okresie (2004-2006), zlecenia badań dotyczyły Kliniki Reumatologii Wieku Rozwojowego (ponad 60%), a następnie Kliniki Reumatologii (ok. 15%, a nawet 23% w 2004 r.). Pozostałe zlecenia świadczyły o marginalności zainteresowania badaniami poszczególnych placówek medycznych w kierunku obecności przeciwciał dla B. burgdorferi.
W kontekście liczby zlecanych badań interesujące wyniki (ryc. 2) dała analiza odsetka rezultatów dodatnich na obecność surowiczych przeciwciał zarówno w poszczególnych latach, jak i średnio w całym okresie badawczym. O ile średni procent wyniósł 16,5, o tyle zdecydowanie najwyższy, powyżej 30%, był stwierdzony u pacjentów Polikliniki Dorosłych, Polikliniki Dziecięcej oraz u osób objętych badaniami doświadczalnymi (Zakład Anatomii Patologicznej). Zdecydowanie najmniej wyników dodatnich (5,5%) stwierdzono u 18 pacjentów Kliniki Reumo-ortopedii i Oddziału Jednego Dnia. Podkreślić należy, że na najwyższy procent (35,5%) wyników dodatnich, wykazany wśród pacjentów Polikliniki Dorosłych, wpłynął ostatni rok analizy (2006 r.), w którym stwierdzono aż 66,6% wyników dodatnich. Z analizy wynika, że zdecydowana przewaga zleceń badań z Kliniki Reumatologii Wieku Rozwojowego nie korespondowała z liczebnością wykrytych przeciwciał (niezależnie od klasy Ig).
Określenie obecności przeciwciał obu klas (IgG i IgM) dla B. burgdorferi, istotne diagnostycznie, wykazało zdecydowaną przewagę przeciwciał wyłącznie klasy IgM, sięgającą średnio 66% wyników dodatnich (tab. I), a klasy wyłącznie IgG - 25%. Obie klasy przeciwciał stwierdzano w ok. 9% analizowanych surowic.
Z uwagi na liczne nieswoiste reakcje krzyżowe i fałszywie dodatnie wyniki w skriningowej metodzie ELISA, mimo wprowadzania antygenów rekombinowanych, dokonano szczegółowej analizy obecności współwystępujących przeciwciał obu ww. klas dla B. burgdorferi oraz często jednocześnie badanych: S. enteritidis, S. typhimurium, Y. enterocolitica O3 i Ch. trachomatis. Punktem odniesienia było 191 surowic, w których wykryto przeciwciała dla B. burgdorferi, a które jednocześnie zgodnie ze zleceniami były badane na obecność wszystkich i/lub niektórych przeciwciał dla ww. drobnoustrojów.
I tak, najczęściej zlecano badania serologiczne surowic w kierunku B. burgdorferi + obu gatunków Salmonella i Y. enterocolitica O3. W tej grupie 99 surowic
(tab. II) stwierdzono wyniki dodatnie na obecność przeciwciał (różnych klas) dla B. burgdorferi, ale równocześ-nie, w tych samych klasach co B. burgdorferi, wykazano przeciwciała dla pozostałych ww. drobnoustrojów, w tym dla jednego gatunku - w 8 surowicach, dla dwóch w 5 surowicach, a dla trzech w 1 surowicy. W sumie w tej grupie surowic jednoczesne współwystępowanie w tych samych klasach stwierdzono w 14 surowicach, co stanowiło 14,1%.
Analiza przeciwciał o odmiennych klasach wykazała obecność 10 surowic ze współwystępującymi przeciwciałami dla Salmonella i/lub Y. enterocolitica O3 w tej grupie 99 surowic, co stanowiło 10,1%. W sumie zatem podejrzewaną krzyżową reaktywność przeciwciał wykazano w 24,2% surowic jednocześnie badanych w kierunku B. burgdorferi, Salmonella i Y. enterocolitica O3.
O ile w tych samych klasach przeciwciał występowały najczęściej jednocześnie przeciwciała dla B. burgdorferi + S. typhimurium (8 surowic), o tyle w różnych klasach dla B. burgdorferi + S. enteritidis (7 surowic).
Drugą stosunkowo liczną grupą surowic (50) były surowice dodatnie na obecność przeciwciał dla B. burgdorferi, badane również w kierunku wszystkich 4 pozostałych przeciwciał. Analiza (tab. II) wykazała, że spośród tych 50 surowic - 8 wykazywało jednoczesną obecność przeciwciał dla innych niż B. burgdorferi drobnoustrojów w tych samych klasach, co stanowiło 16%. W różnych klasach przeciwciał stwierdzono jednoczes-ną obecność innych przeciwciał niż dla B. burgdorferi w 10 surowicach, tj. w 20%. W sumie krzyżową reaktywność przeciwciał w tej grupie zleconych do badań surowic wykazano w 26%. W tych samych klasach przeciwciał dominowały przeciwciała dla B. burgdorferi
+ S. enteritidis - 6 surowic, a w różnych klasach przeciwciał dla B. burgdorferi + Ch. trachomatis - 5 surowic.
Wyniki zbiorcze dotyczące krzyżowej reaktywności przeciwciał dla B. burgdorferi z przeciwciałami dla pozostałych analizowanych drobnoustrojów przedstawiono w tabeli III.

Dyskusja
Mimo że okres analizy badań w kierunku obecności przeciwciał dla B. burgdorferi dotyczył lat 2004-2006, to liczba ich z roku na rok systematycznie rosła, osiągając 626 w 2006 r. W 2008 r. (dane nieopublikowane) była ona ok. 2,5 razy wyższa. Wynika to - jak podejrzewają autorzy pracy - nie tylko z sytuacji epidemiologicznej w Polsce, zwłaszcza centralnej, ale głównie z coraz większego zainteresowania klinicystów diagnozowaniem niesklasyfikowanych zapaleń stawów w aspekcie ich ewentualnego czynnika etiologicznego, którym mogłyby być genogatunki krętków B. burgdorferi sensu lato przenoszone przez kleszcze z rodzaju Ixodes.
Borelioza jest schorzeniem wielonarządowym, trudnym do zdiagnozowania, zwłaszcza w przypadkach braku w wywiadzie lekarskim wyraźnego stwierdzenia faktu ukąszenia przez kleszcza. Jej objawy w postaci choroby reumatycznej, w tym choroby z Lyme, występują stosunkowo rzadko i przeważnie dotyczą okresu późniejszego. Chodzi głównie o dzieci, u których występuje mało charakterystyczny przebieg choroby w wieku rozwojowym oraz trudności w zebraniu wywiadu, w tym przeoczenie momentu ukąszenia przez kleszcza; pojawiające się objawy chorobowe, w tym stawowe, mogą być mylnie wiązane z innym czynnikiem sprawczym. Dlatego prawdopodobnie pediatrzy reumatolodzy Instytutu Reumatologii (zob. ryc. 1) zdecydowanie częściej w porównaniu z innymi zlecają badania w kierunku serodiagnostyki boreliozy, mimo że w piśmiennictwie [20] podkreśla się u dzieci w porównaniu z dorosłymi mniejszą częstość występowania zmian narządowych, zwłaszcza stawowych.
Zapalenia stawów, szczególnie pojedynczych, są opisywane bardzo często u dorosłych, zarówno we wczesnej, jak i późnej fazie choroby. Dlatego nieco zaskakujące dla autorów pracy było zlecanie przez Klinikę Reumatologii Wieku Rozwojowego w analizowanym okresie (2004-2006) badań serologicznych w kierunku boreliozy o charakterze stawowym w odsetkach przekraczających 60% ogółu zleceń pozostałych klinik, oddziałów i innych placówek (ryc. 1). Jedną z głównych przesłanek tego faktu prawdopodobnie było poszukiwanie przez pediatrów odczynowych zapaleń stawów o ewentualnym podłożu infekcyjnym, czego dowodem były najczęściej zlecane badania jednocześnie w kierunku serodiagnostyki jersiniozy i salmonelozy [21, 22]. W grę wchodziła też obawa przed prawdopodobnymi konsekwencjami nierozpoznania boreliozy o cięższych skutkach, np. objawów neurologicznych.
Analizując wyniki badań na obecność przeciwciał w surowicy dla B. burgdorferi (niezależnie od klasy Ig) (ryc. 2), zauważono dużą rozbieżność. Większość wyników dodatnich była wykrywana w 10-20%, w zależności od pochodzenia, ale zauważono zdecydowanie częstszą wykrywalność (> 30%) w surowicach pochodzących od pacjentów obu poliklinik (dorosłych i dzieci) oraz dostarczanych do badań naukowych. Nasuwa się pytanie o przyczynę tak znacznych różnic w wykrywalności przeciwciał dla B. burgdorferi. Czyżby w grę wchodziła częściowo wnikliwość i trafność wywiadu lekarskiego, a nie zbyt rutynowe zlecanie badań? Serologiczna diagnostyka boreliozy, zwłaszcza przy zastosowaniu jedynie przesiewowej metody ELISA, jest obarczona wieloma zastrzeżeniami doprowadzającymi do fałszywie dodatnich i ujemnych wyników [6]. Fałszywie dodatnie wyniki mogą osiągać kilkanaście procent w przypadku przeciwciał klasy IgG, a nawet 40% w przypadku przeciwciał klasy IgM. Ich czynnikiem sprawczym mogą być reakcje krzyżowe w przypadku infekcji, np. krętkiem Treponema pallidum, wirusami Herpes (zwłaszcza Epsteina-Barr) i innych mikroorganizmów, w tym pałeczkami Enterobacteriaceae. Donosi się również o znaczeniu hipergammaglobulinemii w przypadku chorób autoimmunologicznych, chorób tkanki łącznej, w których stwierdza się wysoki poziom przeciwciał dla B. burgdorferi, a jednocześnie objawy kliniczne przypominające boreliozę (zapalenie stawów, objawy neurologiczne) [6].
Fałszywie ujemne wyniki w serodiagnostyce boreliozy mogą natomiast wynikać z:
• zbyt wcześnie wykonanego badania (przed upływem 4 tyg. po zakażeniu),
• obecności niewykrywalnych metodą ELISA swoistych kompleksów immunologicznych,
• jedynie lokalnej (w płynie stawowym i PMR) produkcji przeciwciał,
• wpływu antybiotykoterapii w początkowym etapie choroby,
• wewnątrzkomórkowego przebywania krętka B. burgdorferi, z którym układ immunologiczny nie ma kontaktu.
Istotnym problemem staje się ocena występowania poszczególnych klas przeciwciał dla B. burgdorferi. W niniejszych badaniach, zarówno w poszczególnych latach, jak i ogółem, dominowały w ponad 60% przeciwciała wyłącznie klasy IgM (tab. I), a następnie jedynie klasy IgG (ok. 20-30%). Wiadomo, że rozwój odpowiedzi immunologicznej w zakażeniu B. burgdorferi przebiega w kilku etapach. Produkcja przeciwciał IgM rozpoczyna się 2-4 tyg. od zakażenia, osiągając najwyższy poziom po 6-8 tyg., a po tym czasie stopniowo ulega serokonwersji do klasy IgG. Niemniej jednak obie klasy przeciwciał, mimo spodziewanego obniżenia poziomu IgM, mogą być wykrywane latami, nawet po okresie skutecznej terapii. Wszelkie zaburzenia reakcji immunologicznych (swoistych i nieswoistych) we wczesnym okresie zakażenia mogą unicestwić skuteczną eradykację patogenu w dalszych etapach odpowiedzi, a zarazem doprowadzić do rozwoju stanu przewlekłego choroby. O ile przeciwciała klasy IgM charakteryzują się małym powinowactwem do antygenu, silnie aktywują dopełniacz, o tyle przeciwciała w klasie IgG stanowią główne immunoglobuliny w walce z patogenem.
Metoda ELISA, wysoce czuły, lecz jedynie przesiewowy test, bezwzględnie powinna być potwierdzana zde-cydowanie bardziej swoistym testem immunoblot
(Western-blot). Niezależnie od tego, czy w metodzie immunoenzymatycznej zastosuje się: preparaty antygenowe całych komórek, białek rekombinowanych, syntetycznych peptydów mających selektywne immunoreaktywne epitopy oraz ich różne kombinacje - to nawet wysokie poziomy przeciwciał często wydają się kontrowersyjne. Również z powodu różnorodności antygenowej poszczególnych gatunków Borrelia, preparaty zastosowane w metodzie ELISA powinny obejmować genogatunki występujące na danym obszarze, np. B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii i B. garinii w Europie [1].
Uważa się, że nie ma potrzeby kontrolnych badań poziomu przeciwciał po zastosowanej antybiotykoterapii z uwagi na długi okres półtrwania immunoglobulin i zatem potencjalnie wydłużoną odpowiedź przeciwciałową [6].
Według Schnarr i wsp. [1] racjonalna diagnostyka przy różnych objawach klinicznych boreliozy z Lyme nawet nie wymaga badań serologicznych w przypadku wystąpienia rumienia wędrującego. W tym okresie autorzy ci zalecają jedynie wykonanie hodowli lub PCR bioptatów skórnych. W przypadku neuroboreliozy badanie serologiczne surowicy i płynu mózgowo-rdzeniowego jest podstawowym testem, a uzupełnić je można hodowlą i PCR płynu mózgowo-rdzeniowego. Zapalenie stawów - to diagnostyka serologiczna surowicy
i ewentualnie PCR płynu stawowego lub tkanki synowialnej, a w przypadku acrodermatitis chronica atrophicans oprócz badań serologicznych surowicy zaleca się uzupełniająco hodowlę krętków i PCR bioptatów skórnych.
Bardzo niepokojącym zjawiskiem z punktu widzenia zastosowanej diagnostyki serologicznej B. burgdorferi była - jak stwierdzono również w poprzednich pracach [21, 22] - krzyżowa reaktywność z pozostałymi, badanymi również metodą ELISA, przeciwciałami dla S. enteritidis, S. typhimurium, Y. enterocolitica O3 i Ch. trachomatis. Obniżało to wartość diagnostyczną i stwarzało klinicystom - reumatologom ogromny kłopot w doborze leczenia i określeniu celowości antybiotykoterapii w aspekcie jej skuteczności, wywoływania objawów niepożądanych, ponoszonych kosztów leczenia i wydłużenia czasu pobytu pacjenta w szpitalu (Instytucie). Taka krzyżowa reaktywność miała swoje uzasadnienie w budowie antygenowej ściany komórkowej poszczególnych drobnoustrojów, a zwłaszcza w podstawowych składnikach, tj. LPS, OMP czy LPS-like B. burgdorferi. W przypadku B. burgdorferi trzeba brać pod uwagę niespotykaną u innych bakterii heterogenność i polimorfizm antygenów [23]. Ogromna liczba (> 100) polipeptydów, antygen białkowy główny - CA, o masie cząsteczkowej 60 kDa, kodowany przez gen homologiczny zarówno dla tego drobnoustroju, jak i innych gatunków bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, składniki peptydoglikanu, duża liczba lipoprotein, jak również białko p 41 - podjednostka flageliny (wskazująca na homologię aminokwasów z flagelinami innych krętków) - to tylko część składników odpowiedzialnych za reakcje krzyżowe z przeciwciałami powstałymi po kontakcie z innymi patogenami, w tym krętkami, np. T. pallidum czy Borrelia reccurentis, wywołującymi dur powrotny.

Wnioski
1. Zdecydowana przewaga wykrywanych przeciwciał klasy IgM (ok. 66%) nad przeciwciałami IgG (ok. 25%) mogła sugerować wczesny etap ewentualnego zakażenia B. burgdorferi w większości przypadków.
2. Wysoka czułość i stosunkowo niska swoistość immunoenzymatycznego testu ELISA w wykrywaniu przeciwciał dla B. burgdorferi wyrażała się w ok. 25% krzyżową reaktywnością przeciwciał z innymi drobnoustrojami często badanymi w odczynowych, niesklasyfikowanych zapaleniach stawów. Sprawia to, że metoda ta ma znaczenie wstępne w diagnostyce takich stanów chorobowych i wskazuje, jak bardzo istotne jest wykonywanie testów Western-blot, które dzięki wysokiej swoistości eliminują wyniki fałszywie dodatnie.

Piśmiennictwo
1. Schnarr S, Franz JK, Krause A, et al. Lyme borreliosis. Best Pract Res Clin Rheum 2006; 20: 1099-1118.
2. Klimczak M, Gładysz M, Ząbek J. Diagnostyka różnicowa Lyme-arthritis z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Przegl Epidem 2006; 60: 58-59.
3. Przytuła L, Gińdzieńska-Sieskiewicz E, Sierakowski S. Diagnostyka i leczenie boreliozowego zapalenia stawów. Przegl Epidem 2006; 60: 125-130.
4. Massarotti E. Lyme arthritis. Med Clin North Am 2002; 86: 297-309.
5. Aguero-Rosenfeld ME, Wang G, Schwartz I, et al. Diagnosis of Lyme borreliosis. Clin Microb Rev 2005; 18: 484-509.
6. Witecka-Knysz E, Klimczak M, Lakwa K i wsp. Borelioza: dlaczego diagnostyka jest tak trudna? Diagnosta Lab 2007; 13: 11-13.
7. Ząbek J. Diagnostyka boreliozy - wytyczne dla ośrodków
reumatologicznych. Reumatologia 1999; 39: 25-32.
8. Vormiser GP, Bittker S, Cooper D, et al. Yield of large-volume blood cultures in patients with early Lyme disease. J Infect Dis 2001; 184: 1070-1072.
9. Karlsson M, Ho/vind-Hougen K, Svenungsson B, et al. Cultivation and characterization of spirochetes from cerebro-spinal fluid of patients with Lyme borreliosis. J Clin Microb 1990; 28: 473-479.
10. Karch H, Huppertz HJ, Bohme M, et al. Demonstration of Borrelia burgdorferi DNA in urine samples from healthy humans whose sera contain B. burgdorferi - specific antibodies. J Clin Microb 1994; 32: 2312-2314.
11. Nocton JJ, Dressler F, Rutledge BJ, et al. Detection of Borrelia burgdorferi DNA by polymerase chain reaction in synovial fluid from patients with Lyme arthritis. New Engl J Med 1994;
330: 229-234.
12. Wilske B, Fingerle V, Herzer P, et al. Recombinant immunoblot in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. Comparison with indirect immunofluorescens and enzyme-linked immuno-sorbent assay. Med Microb Immun 1993; 182: 255-270.
13. Liang FT, Steere AC, Marques AR, et al. Sensitive and specific serodiagnosis of Lyme disease by enzyme-linked im-munosorbent assay with a peptide based on an im-munodominant conserved region of Borrelia burgdorferi VLsE. J Clin Microb 1999; 37: 3990-3996.
14. Zajkowska J, Kondrusik M, Grygorczuk S i wsp. Porównanie testów wykrywających przeciwciała przeciw antygenom Borrelia burgdorferi opartych na jednym genogatunku (EIA) i antygenach rekombinowanych (ELISA). Przegl Epidem 2006; 60:
171-176.
15. Flisiak R, Prokopowicz D. Antibodies against B. garinii in diagnosis of Lyme disease. Przegl Lek 2000; 57: 147-149.
16. Flisiak R, Chodynicka B. Antibodies against Borrelia afzelii in patients with an early stage of Lyme disease. Wiad Lek 2001; 54: 19-25.
17. Pancewicz SA, Zajkowska JM, Kondrusik M i wsp. Obecność przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi wśród pracowników leśnych w północno-wschodniej Polsce. Med Prakt 1998; 49:
253-259.
18. Zajkowska J, Kondrusik M, Pancewicz S i wsp. Test Western blot z białkiem VLsE oraz antygenami „in vivo” w diagnostyce boreliozy z Lyme. Przegl Epidem 2006; 60: 177-185.
19. Chmielewska-Badora J, Cisak E, Fatla A. Zastosowanie testu immunoblot w diagnostyce laboratoryjnej boreliozy. Przegl
Epidem 2006; 60: 192.
20. Andrzejewski A, Woźniakowska-Gęsicka T, Wiśniewska-Ligier M. Odrębności przebiegu zakażenia krętkiem Borrelia burgdorferi u dzieci. Przegl Epidem 2006; 60: 16-22.
21. Noworyta J, Brasse-Rumin M, Ząbek J. Ocena wartości serodiagnostyki bakteriologicznej u chorych na niesklasyfikowane zapalenie stawów. Reumatologia 2008; 46: 115-124.
22. Noworyta J, Brasse-Rumin M, Ząbek J. Ocena wartości serodiagnostyki bakteriologicznej u chorych na niesklasyfikowane zapalenie stawów. Część II. Analiza badań surowic na obecność przeciwciał dla Salmonella enteritidis i Salmonella typhimurium; reakcje krzyżowe z Yersinia enterocolitica O3, Chlamydia trachomatis i Borrelia burgdorferi. Reumatologia 2008; 46:
198-209.
23. Zaremba ML, Borowski J. Mikrobiologia lekarska. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1997; 330.