Radioprotective effect of natural anthocyanins

WSTĘP


Skutki oddziaływania promieniowania jonizującego na organizm są uzależnione od wielu czynników zewnętrznych i wewnętrznych. Czynniki wewnętrzne, takie jak:

∙ wiek,

∙ nawodnienie,

∙ zawartość tlenu w organizmie

mają znaczący wpływ na skutki powstałe po pochłonięciu dawki promieniowania jonizującego. Znany jest wpływ efektu tlenowego na dawkę śmiertelną komórki napromieniowanej.



Okazuje się, że w przypadku równoczesnego z niedotlenieniem napromieniowania dawka śmiertelna jest 3-krotnie większa. W niniejszej pracy pokazano wpływ podawanego dożołądkowo naturalnego barwnika i soku z aronii czarnoowocowej na biochemiczne wykładniki procesów wolnorodnikowych zachodzących pod wpływem promieniowania jonizującego.



MATERIAŁ I METODY


Badania przeprowadzono na 77 królikach rasy szynszyla o masie ciała 2,5–3,2 kg i 76 myszach rasy balb C o masie 18,0–21,5 g. Zwierzęta karmiono paszą znormalizowaną, podając im wodę w dowolnej ilości. Przebywały one w zwierzętarni o średniej temp. 18^oC i współczynniku wilgotności względnej 60 proc.

41 królików naświetlono z 3 źródeł o łącznej mocy 9,0 Gy/godz. W trakcie 7-minutowej ekspozycji zwierzęta pochłonęły dawkę 1,05 Gy. 18 królików i 40 myszy naświetlono z 3 źródeł o łącznej mocy 14 Gy/godz. Przez 17 min i 14 s zwierzęta z tej grupy pochłonęły 4 Gy.



Zwierzęta podzielono na 6 grup:

∙ grupę zwierząt otrzymującą dożołądkowo 0,9 proc. NaCl w ilości 1 ml/kg m.c. – 6 królików i 12 myszy,

∙ grupę zwierząt otrzymującą dożołądkowo 1ml/kg m.c. naturalny barwnik antocyjaninowy w rozcieńczeniu 1:10 (stężenie pierwotne ok. 1 000 mg proc.) – 6 królików,

∙ grupę zwierząt otrzymującą dożołądkowo 1 ml/kg m.c. zagęszczony sok z aronii w rozcieńczeniu 1:10 (stężenie pierwotne ok. 1 000 mg proc.) – 6 królików,

∙ grupę zwierząt naświetloną i otrzymującą dożołądkowo 0,9 proc. NaCl w ilości 1 ml/kg m.c. – 20 królików i 14 myszy,

∙ grupę zwierząt naświetloną i otrzymującą dożołądkowo 1 ml/kg m.c. barwnik antocyjaninowy w rozcieńczeniu 1:10 (stężenie pierwotne ok. 1 000 mg proc.) – 19 królików i 12 myszy,

∙ grupę zwierząt naświetloną i otrzymującą dożołądkowo 1 ml/kg m.c. sok z aronii w rozcieńczeniu 1:10 (stężenie pierwotne ok. 1 000 mg proc.) – 20 królików i 14 myszy.



Napromieniowania zwierząt dokonano w komorze radiacyjnej Instytutu Techniki Radiacyjnej Politechniki Łódzkiej. Do napromieniowania zwierząt użyto izotopowego urządzenia radiacyjnego, w którym źródłem promieniowania jest Co⁶⁰ wysyłający promieniowanie gamma o energii ok. 1,23 MeV. Komora, posiadająca 20 źródeł Co⁶⁰ ma łączną aktywność ok. 30 kCi.



POMIAR CHEMILUMINESCENCJI (CL)


Pomiar chemiluminescencji wg Čiž i Lojek (Čiž i wsp. 1993) polega na pomiarze ilości fotonów światła powstającego przy przechodzeniu ze stanu wzbudzonego w stan spoczynkowy samych wolnych rodników lub związków powstałych w wyniku ich reakcji z cząstkami organicznymi komórki.



150 g śledziony myszy homogenizowano w 2 ml płynu odżywczego (MEM). Następnie mieszaninę wirowano przez 10 min. Otrzymany osad płukano 2-krotnie PBS. Pomiaru chemiluminescencji (CL) dokonywano Luminometrem 1251 (Pharmacia LKB) z rejestracją komputerową (IBM PC AT). Badania przeprowadzono w temp. 37^oC. Badana próbka zawierała 200 tys. komórek, 20 μl luminolu i 30 μl opsonizowanego surowicą zymosanu A. Pole powierzchni pod krzywą emisji powstałej podczas 30-minutowego badania stanowiło miarę chemiluminescencji.


OZNACZANIE ANIONORODNIKA

PONADTLENKOWEGO WE KRWI


Oznaczono anionorodnik ponadtlenkowy we krwi pełnej metodą Bellavite (Bellavite i wsp. 1983), opartą na redukcji cytochromu C w obecności dysmutazy ponadtlenkowej i 0,1 ml pełnej krwi. Odczytana ekstynkcja przy długości światła 550 nm z nadsączu do powietrza daje wartość generacji anionorodnika ponadtlenkowego. Wartość stymulowaną uzyskuje się po stymulacji próby zymosanem. Wyniki wyrażono w nmol/kom/min.



WYNIKI


Średnia liczba leukocytów u królików przed napromieniowaniem wynosiła 5 450 w 1 μl. W tab. 1. przedstawiono średnią liczbę leukocytów we krwi obwodowej królików i stymulowane generowanie anionorodnika ponadtlenkowego po pochłonięciu dawki 1,05 Gy promieniowania gamma. Tab. 2. przedstawia średnią liczbę leukocytów we krwi obwodowej królików oraz stymulowane generowanie rodnika ponadtlenkowego po pochłonięciu dawki 4,0 Gy promieniowania gamma.



Po pochłonięciu dawki 4 Gy promieniowania gamma następuje znamienne obniżenie liczby leukocytów we krwi obwodowej królików. Po pochłonięciu dawki 1,05 Gy promieniowania gamma następuje wzrost liczby leukocytów we krwi obwodowej królików we wszystkich oznaczanych przedziałach czasowych, statystycznie znamienny w 10. dobie po napromieniowaniu. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono znamienne statystycznie wzmożenie generacji rodnika ponadtlenkowego w 4. dobie od pochłonięcia dawki 1,05 Gy oraz po 48 godz. i w 4. dobie po pochłonięciu dawki 4 Gy promieniowania gamma. Podanie barwnika antocyjaninowego w istotny sposób hamuje generację rodnika ponadtlenkowego w 4. dobie po pochłonięciu dawki promieniowania 4 Gy. W 3. dobie po pochłonięciu dawki 4 Gy promieniowania gamma barwnik antocyjaninowy, jak i zagęszczony sok, zwiększają chemiluminescencję splenocytów. Podanie naturalnego barwnika antocyjaninowego napromieniowanym zwierzętom poprawia wartości liczbowe leukocytów. Znamienności statystyczne stwierdza się w grupie zwierząt, które pochłonęły dawkę 1,05 Gy promieniowania gamma.



DYSKUSJA


W przeprowadzonych badaniach użyto promieniowania gamma ze źródła Co⁶⁰. Wybór tego rodzaju promieniowania był podyktowany następującymi czynnikami;

∙ jest to promieniowanie posiadające silne właściwości przenikające, wywołuje jonizację i wytwarza znaczne ilości wolnych rodników,

∙ źródła promieniowania gamma mają szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach życia, a tym samym mogą oddziaływać na organizmy żywe,

∙ w sytuacjach awaryjnych może nastąpić ekspozycja na promieniowanie jonizujące lub skażenie środkami radioaktywnymi ludzi.



Promieniowanie jonizujące wywołuje cały szereg zmian chorobowych w napromieniowanym organizmie, a wśród nich zaburzenia w składzie krwi (Passi i wsp. 1991), zmiany w jelitach (Tamou i wsp. 1994), wątrobie (Legonkova i wsp. 1990) i na skórze (Sato i wsp. 1990).



W badaniach własnych obserwowano zwiększoną śmiertelność zwierząt, wzmożoną utratę owłosienia, zmiany ropne oka napromieniowanego oraz biegunkę. Podczas wycinania narządów u myszy w 4. dobie po pochłonięciu dawki 4,0 Gy zaobserwowano łatwe rozpadanie się narządów miąższowych.



Wybór królików do badań uwarunkowany był wieloma czynnikami. Możliwość okresowego pobierania od królików krwi do badań pozwalała na śledzenie zmian w zachowaniu się badanych parametrów biochemicznych oraz obrazu krwi u tych samych osobników w czasie. Wielkości zastosowanych dawek były podyktowane doniesieniami literaturowymi, co umożliwiało porównywanie wyników (Spiers i wsp. 1990). Zaobserwowano, że po 1. godz. od napromieniowania nastąpił krótkotrwały wzrost liczby limfocytów. Określona liczba limfocytów w 2. i 4. dobie stanowiła 50 proc. liczby limfocytów obliczonych godzinę po napromieniowaniu. Po dawce 4,0 Gy stwierdzono znaczne zmniejszenie wszystkich wartości morfologicznych krwi w analogicznych okresach obserwacji. Zachowanie obrazu krwi obwodowej w zależności od dawki zaobserwował Pospisil i wsp. (1993). Po pochłonięciu dawki 1,05 Gy nastąpił wzrost wartości krwinek we wszystkich przedziałach czasowych. Najwyższe wartości obserwowano w 10. dobie po napromieniowaniu.



Wiele uszkodzeń popromiennych powstaje na skutek działania wolnych rodników. Mają one odgrywać w patogenezie choroby popromiennej zasadniczą rolę. W badaniach własnych oceniono biochemiczne wykładniki tych procesów (generowanie rodników ponadtlenkowych przez granulocyty krwi obwodowej i chemiluminescencję komórek śledzionowych). Rodnik ponadtlenkowy powstaje w warunkach fizjologicznych podczas jednoelektronowego utleniania zachodzącego w łańcuchu oddechowym w ok. 5 proc. Jego zwiększone powstawanie wywołane jest licznymi czynnikami, a ze względu na łatwość jego powstawania przypuszcza się, że jest odpowiedzialny za występowanie uszkodzenia, czego efektem było wzmożenie peroksydacji lipidów błon komórkowych, obserwowane również przez innych autorów (Gardes i wsp. 1993). W badaniach własnych użyto także metody chemiluminescencji komórek śledzionowych myszy, dzięki której zmierzono ilość fotonów światła powstających przy przechodzeniu ze stanu wzbudzonego w stan spoczynkowy samych wolnych rodników lub związków utworzonych w wyniku ich reakcji z cząsteczkami organicznymi komórki, co w istotny sposób potwierdza działanie aktywnych form tlenu po napromieniowaniu zwierząt (Čiž i wsp. 1993). Od wielu lat podejmowane są liczne próby leczenia choroby popromiennej za pomocą środków pochodzenia naturalnego (Sato i wsp. 1990 i 1991, Svistusenko i wsp. 1990, Gyorgy i wsp. 1992, Sekiguchi i wsp. 1994). Wybór naturalnych barwników antocyjaninowych do leczenia choroby popromiennej uwarunkowany był szeregiem przedstawionych poniżej właściwości:

∙ małą toksycznością naturalnego barwnika antocyjaninowego (powyżej 12 g/kg m.c. u myszy),

∙ łatwą dostępnością,

∙ naturalnym pochodzeniem, szerokim rozpowszechnieniem w świecie roślinnym (Zoliger i wsp. 1991),

∙ jako flawonoidy wywierają korzystny wpływ na układ krążenia (Gyorgy i wsp. 1955, Wagner i wsp. 1986 i 1991), szczególnie na ściany naczyń krwionośnych i na przewód pokarmowy (Magistretti i wsp. 1988, Wagner i wsp. 1992),

∙ hamują działanie antymitotyczne, wywołane związkami alkilującymi (Bertram i wsp. 1991),

∙ działają cytotoksycznie na komórki nowotworowe (Cassady i wsp. 1990, Middleton i wsp. 1992),

∙ wywierają dużą aktywność antyoksydacyjną być może poprzez hamowanie oksydazy ksantynowej (Yuting i wsp. 1990),

∙ działają radioochronnie (Gardes i wsp. 1993).



Mechanizm ochronnego działania naturalnego barwnika antocyjaninowego oparty jest prawdopodobnie na zmniejszaniu procesów utleniania. W badaniach własnych podczas oceny spoczynkowej i stymulowanej generacji rodnika ponadtlenkowego stwierdzono zwiększoną stymulację rodnika ponadtlenkowego w grupie stymulowanej zymosanem po 48 godz. i w 4. dobie od pochłonięcia dawki 1,05 lub 4,0 Gy. Analogiczne zwiększenie generacji rodnika ponadtlenkowego pod wpływem promieniowania jonizującego stwierdził Sekiguchi i wsp. (1994). Podanie naturalnego barwnika antocyjaninowego znamiennie obniżyło w 4. dobie po pochłonięciu dawki 4,0 Gy stymulowaną generację rodnika ponadtlenkowego. U myszy w 3. dobie po napromieniowaniu zaobserwowano największe zahamowanie chemiluminescencji komórek śledzionowych w grupie zwierząt jedynie napromieniowanych. W 14. dobie największe zahamowanie stwierdzono w grupie zwierząt otrzymujących dodatkowo barwnik. Obniżenie chemiluminescencji komórek śledzionowych po dawce 4,0 Gy sugeruje, że w wyniku promieniowania jonizującego nastąpiło uszkodzenie komórek śledzionowych, co miało swoje odzwierciedlenie w wyglądzie morfologicznym całego narządu. Oceniając wszystkie badane parametry biochemiczne oraz morfologiczne, jak również biorąc pod uwagę śmiertelność zwierząt w grupach badanych, potwierdza się obserwacje innych autorów o antyoksydacyjnych właściwościach naturalnego barwnika antocyjaninowego.


PIŚMIENNICTWO

1. Bellavite P, Della B, Serra C. The measurement of superoxide anion production by granulocytes in whole blood. A clinical test for the evaluation of phagocyte function and serum opsonic capacity. Eur J Clin Invest 1983; 13: 363-8.

2. Bertram B, Pool-Zobel BL. Möglichkeiten der Tumortherapie mit Flawonoiden. Zeitschrift für Phytotherapie 1991; 12: 51.

3. Cassady JM, Baird WM, Chang CJ. Natural products as a source of potential cancer chemotherapeutic and chemopreventiv agents. J Nat Prod 1990; 53: 23-6.

4. Chen YT, Zheng RL, Jia ZJ, et al. Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Radic Biol Med 1990; 9: 19-21.

5. Čiž M, Lojek A. Kinetics of luminol-enhanced chemiluminescence induced in murine splenocytes and bone marrow cells by various stimulating agents. Folia Biologica Praha 1993; 39: 106-16.

6. Gardes-Albert M, Ferradini C, Sekaki A, et al. Oxygen-centered free radicals and their interactions with EGb761 or CP 202. Advances in Ginkgo biloba Extract Research. Elsevier, Paris 1993; 2.

7. Gyorgy I, Antus S, Blazovics A, et al. Substituent effects in the free radical reactions of silybin: radiation-induced oxidation of flavonoid at neutral pH. Int J Radiat Biol 1992; 61: 603-9.

8. Legonkova LF, Abacumov GZ, Bushma MI, et al. Changes in UDP – glucuronosyl-glutathion-S-transferase and lipid peroxidation in rat liver microsomes during gamma-irradiation and protective effect of alpha-tocopherol. Vopr Med Khim 1990; 36: 26-8.

9. Magistretti M, Conti M, Cristoni A, et al. Antiulcer activity of an anthocyanidin from Vaccinium myrillus. Arzneim-Forsch Drug Res 1988; 38: 686-70.

10. Middleton E, Kandaswami C. Effects of flavonoides on immune response and inflammatory cell functions. Biochem Pharmacol 1992; 43: 1167-74.

11. Passi S, Picardo M, Zompetta C, et al. The oxyradical-scavenging activity of azelaic acid in biological systems. Free Radic Res Commun 1991; 15: 17-28.

12. Sato Y, Ohta S, Shinoda M. Studies on chemical protectors against radiation. XXXI. Protection effects of Aloe arborescens on skin injury induced by X-irradiation. Yakugaku-Zasshi 1990; 110: 876-84.

13. Sato Y, Ohta S, Shinoda M. Studies on chemical protectors against radiation. XXVIIII. Protective effect of nucleic acid constitutional compounds on radiation demages induced by X-irradiation. Yakugaku-Zasshi 1990; 110: 210-17.

14. Sato Y, Kumazawa N, Suzuki M, et al. Studies on chemical protectors against radiation. XXXIII. Protective mechanisms of various compounds against skin injury induced by radiation. Yakugaku-Zasshi 1991; 111: 51-8.

15. Sekiguchi T, Nagamine T. Inhibition of free radical generation by biotin. Biochem Pharmacol 1994; 3: 594-96.

16. Spiers EM, Watson NT, Swanaon Beck J, Chapman JV, Dettmar PW. The effect of fenclofenac on the regeneration of lymphocytes in rats following total body irradiation. Int J Immunopharmac 1993; 8: 865-75.

17. Svistusenko DA. Ascorbic acid radicals induced by the action of radiation in tissues from rat organs frozen at 77KJ. Izv Akad Nauk SSSR Biol 1990; 6: 827-34.

18. Szent-Györgyi. Perspectives for the bioflavonoides. Ann NY Acad Sci 1955; 61: 732-39.

19. Tamou S, Trott KR. Modification of late radiation damage in the rectum of rats by deproteinized calf blood serum (Acto Horm) and pentoxifylline (PTX). Strahlenther-Onkol 1994; 170: 415-20.

20. Wagner H, Elbl G. ACE -inhibitory procyanidins from Lespedeza capitata. Planta Med 1992; 297-303.

21. Wagner H, Elbl G, Lotter H, et al. Evaluation of natural products as inhibitors of angiotensin I converting enzyme (ACE). Pharm Pharmacol Lett 1991; 1: 15-24.

22. Wagner H, Geyer B, Kiso Y, et al. Coumestans as the main active principles of the liver drugs Eclipla alba and Wedalia colendulacea. Plant Med. 1986; 1: 370-81.

23. Yoon SC, Park JM, Jang HS, et al. Radioprotective effect of captopril on the mouse jejunal mucosa. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1994; 30: 873-78.

24. Yuting C, Rongliang Z, Zhongijan J, et al. Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Radic Biol Med 1990; 9: 19-28.

25. Zhao B, Li X, He R. G, et al. Scavening effects of green tea and natural antioxidants on active oxygen radicals. Mol Cel Biochem 1989; 14: 175-79.


ADRES DO KORESPONDENCJI

dr Grzegorz Andryskowski

Zakład Medycyny Nuklearnej

Wojskowej Akademii Medycznej

ul. Żeromskiego 113

90-549 Łódź