eISSN: 2299-0038
ISSN: 1643-8876
Menopause Review/Przegląd Menopauzalny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Special Issues Editorial board Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors Publication charge Ethical standards and procedures
Editorial System
Submit your Manuscript
SCImago Journal & Country Rank


3/2002
vol. 1
 
Share:
Share:

The 5A/6A promoter polymorphism of matrix metalloproteinase 3 (MMP-3) gene in menopausal women with ovarian cancer

Andrzej Kulig
,
Beata Smolarz
,
Elżbieta Kozłowska
,
Hanna Romanowicz-Makowska
,
Krzysztof Szyłło
,
Mariusz Niewiadomski
,
Tomasz Rechberger

(Prz Menopauz 2002, 3: 21–25)
Online publish date: 2004/03/03
Article file
- Polimorfizm.PDF  [0.25 MB]
Get citation
 
 
Proces progresji nowotworów charakteryzuje się złożonym, wieloetapowym przebiegiem [22]. Jednym z pierwszych mechanizmów aktywowanym podczas inwazji i metastazy nowotworu jest proteoliza, zachodząca przy udziale różnych typów enzymów proteolitycznych: proteaz cysteinowych (katepsyn B, H i L), proteaz aspartylowych (katepsyna D), proteaz serynowych (białka układu aktywacji plazminogenu i plazmina) oraz metaloproteaz (MMP) [13, 17, 18]. W wyniku skoordynowanego działania metaloproteaz macierzowych oraz ich inhibitorów dochodzi do degradacji elementów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz błony podstawnej, co umożliwia migrację komórkom rakowym [3, 15]. MMP obejmują rodzinę 17 enzymów proteolitycznych: kolagenaz, żelatynaz oraz stromielizyn, które w prawidłowych warunkach fizjologicznych uczestniczą w procesach remodelingu tkanek. Niektóre spośród metaloproteaz posiadają zdolność degradacji kolagenu typu I, II oraz III [12].
W chorobach nowotworowych obserwuje się zmianę poziomu ekspresji następujących metaloproteaz: MMP-1, MMP-2, MMP-3 oraz MMP-9, której konsekwencją jest zmiana poziomu kodowanego białka. Podwyższony poziom tych białek jest skorelowany z krótszym okresem bez nawrotu choroby i krótszym czasem przeżycia u chorych na różne nowotwory [1, 2, 6, 7, 9, 12, 16].
Zmiany syntezy MMP-3 są zazwyczaj poprzedzane zmianami w transkrypcji genu i poziomie mRNA, dlatego też wkład w syntezę MMP-3 może mieć zmienność sekwencji genu [10, 14]. Gen MMP-3 jest polimorficzny i wobec znaczącej roli metaloproteaz w progresji nowotworów ważne wydaje się poznanie roli polimorfizmów w rozwoju raka [25]. Polimorfizm 5A/6A zlokalizowany w regionie promotorowym genu MMP-3 może mieć istotny wpływ na regulację jego ekspresji. Większość badań wskazuje, że polimorfizm 5A/6A może być związany z rozwojem niektórych chorób sercowo-naczyniowych [21, 25], lecz niewiele wiadomo o jego roli w chorobach nowotworowych. W obecnej pracy badano rozkład genotypów i częstości alleli polimorfizmu 5A/6A u chorych na raka jajnika.


Materiał i metody


Pacjenci. Materiał do badań stanowiły próbki tkanki pobrane od 50 pacjentek w okresie menopauzalnym, u których badaniem histopatologicznym stwierdzono raka jajnika. Próbki tkanek z guzów jajnika były utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie. Stopień zaawansowania nowotworu oceniany był wg klasyfikacji FIGO (ang. International Federation of Gynaecology and Obstetrics). Grupę kontrolną stanowiły próbki krwi pobrane od 50 dobranych wiekowo kobiet, u których nie stwierdzono występowania raka jajnika.
Izolowanie DNA. DNA do badań izolowano z zastosowaniem komercyjnie dostępnego zestawu OIAmp Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy).
Oznaczanie polimorfizmu 5A/6A. Polimorfizm 5A/6A obszaru promotorowego genu MMP-3 był określany poprzez reakcję PCR ze starterami allelospecyficznymi: 5’-GTA TGG GCT CGT AAAAAG-3’ dla allelu 5A i 5’-GTA TGG GCT CGT AAAAAA-3’ dla allelu 6A, każdy w oddzielnej reakcji PCR, razem ze starterami: 5’-TGC AGC GCT GGT CGT TAG TGT GACT-3’ oraz 5’-GAA CTT ATT CCA GGT TAA GGG TGCTG-3’ dla zweryfikowania amplifikacji DNA przy braku odpowiedniego allelu w genomowym DNA. Reakcja PCR została przeprowadzona w termocyklerze DNA Thermal Cycler (GeneAmp PCR System 2400; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Warunki reakcji PCR były następujące: 30 s w 94°C, 30 s w 57°C, 40 s w 72°C, przez 35 cykli. Mieszanina reakcyjna (25 ml) obejmowała: 30 ng genomowego DNA, 0,2 µmol każdego startera (ARK Scientific GmbH Biosystems, Darmstad, Niemcy), 2,5 mM MgCl2, 1 mM dNTP (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy) and 1 U polimerazy Taq (Qiagen GmbH, Hilden, Niemcy). Amplifikowane fragmenty DNA rozdzielane były w 5-procentowym żelu poliakryloamidowym i po barwieniu bromkiem etydyny obserwowane w świetle UV. Każda próbka przypisywana była do jednego z genotypów: 5A/5A, 5A/6A lub 6A/6A [ryc. 1].
Analiza statystyczna. Rejestrowana liczba każdego z genotypów była porównywana z liczbą oczekiwaną na podstawie prawa Hardy’ego-Weinberga z użyciem testu χ2. Istotność różnic pomiędzy częstościami alleli i genotypów dla poszczególnych grup oceniana była testem χ2.


Wyniki


Po przeprowadzeniu reakcji PCR wszyscy pacjenci zostali podzieleni na 3 grupy ze względu na ich genotypy: homozygoty 5A/5A i 6A/6A oraz heterozygoty 5A/6A.

W pierwszym etapie badań skoncentrowano się na analizie polimorfizmu 5A/6A u chorych na raka jajnika oraz u osób, u których nie stwierdzono choroby nowotworowej. Populacja chorych na nowotwór oraz grupa kontrolna były jednorodne pod względem płci (kobiety) oraz dobrane wiekowo. W grupie chorych nie zaobserwowano związków pomiędzy polimorfizmem 5A/6A a występowaniem raka jajnika. Częstości alleli 5A i 6A w grupie badanej nie różniły się istotnie (p>0,05) od częstości alleli w grupie kontrolnej (tab.I.). Rozkład genotypów w obu przypadkach nie odbiegał od rozkładu przewidywanego przez prawo Hardy’ego-Weinberga.
Badaniom została poddana także grupa pacjentek o różnym stopniu zaawansowania raka jajnika. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w rozkładach genotypów i częstości alleli (p >0,05) pomiędzy badanymi grupami. Rozkład genotypów był zgodny z rozkładem przewidywanym przez prawo Hardy’ego-Weinberga (tab. II.).


Dyskusja


Białka z rodziny metaloproteaz macierzowych umożliwiają inwazję komórkom rakowym w wyniku degradacji składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Ich działanie jest ściśle związane z regulacją ekspresji kodujących je genów [2]. Wiadomo, że ekspresja genu MMP-3 podlega zmianom podczas różnorodnych patologicznych procesów, jak inwazja i metastaza nowotworów [9]. Regulacja ekspresji genu MMP-3 zachodzi w konsekwencji oddziaływania różnych endogennych i egzogennych czynników z odpowiednimi regionami promotora. Konsekwencją zmienionej ekspresji jest zazwyczaj zmiana poziomu białka MMP-3, obserwowana u chorych na nowotwory [1, 6, 7, 8, 16]. Przypuszcza się, że zmienność genu może wpływać na zmianę poziomu biosyntezy MMP-3.
Położenie polimorfizmu 5A/6A w regionie promotora genu MMP-3 wskazuje na jego możliwą rolę w regulacji ekspresji genu na poziomie transkrypcji. Przypuszcza się, że polimorfizm 5A/6A może być związany z regulacją aktywności promotora MMP-3 poprzez czynniki Ets [11, 24]. Rodzina czynników transkrypcyjnych Ets obejmuje ponad 30 białek, które charakteryzują się obecnością konserwatywnego motywu – domeny ETS. Ets rozpoznają specyficzną sekwencję nukleotydową GGAA/T [20, 23]. Miejsce wiązania dla czynników transkrypcyjnych z rodziny Ets znajduje się w obrębie promotorów genów kodujących metaloproteazy.
Białka z rodziny Erg oraz Ets mogą regulować ekspresję genu MMP-3 poprzez oddziaływanie z kompleksem białkowym Fos/Jun [11]. Czynniki transkrypcyjne Fos i Jun, produkty onkogenów jun oraz fos, uczestniczą w tworzeniu białka AP-1, które funkcjonuje jako homodimer Jun/Jun i heterodimer Jun/Fos. Ets stymulują czynnik transkrypacyjny AP-1, który wiąże się w obszarze promotora MMP-3 [4].
Polimorfizm 5A/6A może być związany z aktywnością promotora genu MMP-3 i wpływać na jego transkrypcję w wyniku stymulacji niektórych czynników transkrypcyjnych poprzez cytokiny (interleukiny, czynnik martwicy nowotworu α [TNFα]) uwalniane przez komórki nowotworowe [19].
Polimorfizm 5A/6A został przebadany w niektórych chorobach sercowo-naczyniowych [21, 25]. Zauważono, że częstość allelu 5A była znacząco wyższa w porównaniu z 6A. Powyższe wyniki zasugerowały możliwość zastosowania polimorfizmu 5A/6A jako markera w tych chorobach [21, 25].
W chwili obecnej niewiele wiadomo o znaczeniu polimorfizmu 5A/6A w nowotworach złośliwych. Ze względu na duże znaczenie problemu wczesnego wykrywania i leczenia tych chorób istotne wydaje się zbadanie związków pomiędzy polimorfizmami a występowaniem i rozwojem nowotworów.
W obecnych badaniach, które objęły 50 kobiet w wieku menopauzalnym chorych na raka jajnika nie wykazano związku pomiędzy polimorfizmem 5A/6A a jego występowaniem. Nie było znaczących różnic w częstości alleli 5A i 6A pomiędzy kobietami z rakiem jajnika a grupą kontrolną. Rozkład genotypów u pacjentów i w kontroli nie różnił się od rozkładu Hardy’ego-Weinberga. Poza tym nie znaleziono różnic pomiędzy rozkładem genotypów w grupach o różnym stopniu zaawansowania nowotworu, co wskazuje na brak związku pomiędzy polimorfizmem a rozwojem raka.
Wyniki sugerują, że polimorfizm 5A/6A genu MMP-3 może nie być bezpośrednio związany z występowaniem i rozwojem raka jajnika, jednakże konieczne są badania większej populacji dla potwierdzenia tego przypuszczenia.


Piśmiennictwo:

1. Balduyck M, Zerimech F, Gouyer V. Specific expression of matrix metalloproteinases 1, 3, 9 and 13 associated with invasiveness of breast cancer cells in vitro. Clin Exp Metastasis 2000; 18: 171-8.
2. Baruch RR, Melinscak H, Lo J. Altered matrix metalloproteinase expression associated with oncogene-mediated cellular transformation and metastasis formation. Cell Biol Int 2001; 25: 411-20.
3. Behrens J. The role of cell adhesion molecules in cancer invasion and metastasis. Breast Cancer Res. Treat 1993; 24: 175-184.
4. Benbow U, Brinckerhoff CE. The AP1 site and MMP gene regulation: what is all the fuss about? Matrix Biol 1997; 15: 519-526.
5. Berek JS, Fu YS, Hacker NF. Ovarian cancer. In: Berek J. S., Adashi EY, Hillard PA, eds. Novak’s Gynecology. Baltimore: Williams & Wilkins 1996, 1155-1230.
6. Birkedal-Hansen B, Pavelic ZP, Gluckman JL. MMP and TIMP gene expression in head and neck squamous cell carcinomas and adjacent tissues. Oral Dis 2000; 6: 376-82.
7. Bodey B, Bodey BJr, Siegel SE. Immunocytochemical detection of matrix metalloproteinase expression in prostate cancer. In-Vivo 2001; 15: 65-70.
8. Bodey B, Bodey BJr, Siegel SE. Immunocytochemical detection of the expression of members of the matrix metalloproteinase family in adenocarcinomas of the pancreas. In-Vivo 2001; 15: 71-76.
9. Bodey B, Bodey BJr, Siegel SE. Matrix metalloproteinase expression in malignant melanomas: tumor-extracellular matrix interactions in invasion and metastasis. In-Vivo 2001; 15: 57-64.
10. Borden P, Heller R. Transcriptional control of matrix metalloproteinases and the tissue inhibitors of matrix metalloproteinases. Crit Rev Eukaryotic Gene Expr 1997; 7: 159-178.
11. Buttice G, Duterque-Coquillaud M, Basuyaux JP. Erg and Ets family member, differentially regulates human collagenase-1 (MMP-1) and stromelysin 1 (MMP-3) gene expression by physically interacting with the Fos/Jun complex. Oncogene 1996; 13: 2297-2306.
12. Chambers AF, Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 1260-1270.
13. Dano K, Romer J, Nielsen BS. Cancer invasion and tissue remodeling — cooperation of protease systems and cell types. APMIS 1999; 107: 120-127.
14. Delany AM, Brinckerhoff CE. Post-transcriptional regulation of collagenase and stromelysin gene expression by epidermal growth factor and dexamethasone in cultured human fibroblast. J Cell Biochem 1990; 50: 400-410.
15. Henriet P, Blavier L, DeClerck YA. Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) and proliferation. APMIS 1999; 107: 111-119,
16. Kolomecki K, Stepien H, Bartos M. Usefulness of VEGF, MMP-2,
MMP-3 and TIMP-2 serum level evaluation in patients with adrenal tumours. Endocr Regul 2001; 35: 9-16.
17. Meyer T, Hart IR. Mechanisms of tumour metastasis. Eur J Cancer 1998; 34: 214-221.
18. Mignatti P, Rifkin DB. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol Rev 1993; 73: 161-195.
19. Muller D, Li DQ, Tseng SC. Regulation of collagenase, stromelysin and gelatinase B in human conjunctival and conjunctivochalasis fibroblasts by interleukin 1-beta and tumor necrosis factor alpha. Invest. Ophthalmol. Vis Sci 2000; 41: 2922-2929.
20. Sapi E, Flick M, Rodov S. Ets-2 transdominant mutant abolishes anchorage-independent and macrophage colony-stimulating factor-stimulated invasion by BT20 breast carcinoma cells. Cancer Res 1998; 58: 1027-1033.
21. Satsangi J, Chapman RW, Haldar N. A functional polymorphism of the stromelysin gene (MMP-3) influences susceptibility to primary sclerosing cholangitis. Gastroenterology 2001; 121: 124-30.
22. Van Noorden JF, Meade-Tollin LC, Bosman FT. Metastasis. Am Sci 1998; 86: 130-141.
23. Wasylyk B, Hahn SL, Giovane A. The Ets family of transcription factors. Eur J Biochem 1993: 211: 7-18.
24. White LA, Maute C, Brinckerhoff CE. Ets sites in the promoters of the matrix metalloproteinases collagenase (MMP-1), stromelysin (MMP-3) are auxilliary elements that regulate basal and phorbol-induced transcription. Connect Tissue Res 1997; 36: 321-335.
25. Yoon S, Tromp G, Vongpunsawad RA. Genetic analysis of MMP-3, MMP-9 and PAI-1 in Finnish patients with abdominal aortic or intracranial aneurysms. Biochem Biophys Res Commun 1999; 265: 563-568.


Adres do korespondencji:

Beata Smolarz
Pracownia Biologii Molekularnej, Zakład Patomorfologii Klinicznej
Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki
Rzgowska 281/289
93-338 Łódź
tel. +48-42 271 12 80
faks +48-42 271 14 21
Copyright: © 2004 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.