eISSN: 2084-9834
ISSN: 0034-6233
Reumatologia/Rheumatology
Bieżący numer Archiwum Artykuły zaakceptowane O czasopiśmie Suplementy Rada naukowa Bazy indeksacyjne Prenumerata Kontakt Zasady publikacji prac
NOWOŚĆ
Portal dla reumatologów!
www.ereumatologia.pl
SCImago Journal & Country Rank
 
6/2005
vol. 43
 
Poleć ten artykuł:
Udostępnij:
więcej
 
 


ARTYKUŁ PRZEGLĄDOWY/REVIEW PAPER
Podstawowe zasady racjonalnej serodiagnostyki autoprzeciwciał markerowych w układowych chorobach tkanki łącznej

Jakub Ząbek

Ru 2005; 43, 6: 335-340
Data publikacji online: 2005/12/22
Plik artykułu:
- Podstawowe zasady.pdf  [0.09 MB]
Pobierz cytowanie
ENW
EndNote
BIB
JabRef, Mendeley
RIS
Papers, Reference Manager, RefWorks, Zotero
AMA
APA
Chicago
Harvard
MLA
Vancouver
 
 
Choroby z autoimmunizacją to bardzo szeroka i zróżnicowana klinicznie grupa przewlekłych, nierzadko poważnych w swych konsekwencjach schorzeń o nieznanej etiopatogenezie. Schorzenia te obejmują wiele chorób, w tym tzw. układowe choroby tkanki łącznej (znane szerzej jako choroby reumatyczne) oraz takie jednostki, jak choroba Hashimoto, choroba Addisona, choroba Gravesa-Basedova oraz wiele innych, zaliczanych do grupy chorób z autoimmunizacją narządowo swoistą [1, 2]. Wielu autorów podkreśla przypuszczalną infekcyjną etiopatogenezę chorób z autoimmunizacją, czego śladem mogłaby być krzyżowa reaktywność wielu autoprzeciwciał markerowych z antygenami bakteryjnymi i wirusowym [3–7].
Cechą wspólną tych jednostek chorobowych jest występowanie w krążeniu autoreaktywnych przeciwciał (autoprzeciwciał) oraz limfocytów skierowanych przeciwko antygenom własnym gospodarza [9–11]. Autoprzeciwciała mogą być skierowane przeciwko antygenom powszechnie występującym w organizmie gospodarza (mówimy wtedy o autoimmunizacji narządowo nieswoistej lub układowej) bądź antygenom swoistym tylko dla określonej tkanki (jest to przypadek autoimmunizacji narządowo swoistej).
W układowych chorobach tkanki łącznej występuje wiele zaburzeń mechanizmów odpornościowych, prowadzących do występowania tzw. autoprzeciwciał, czyli przeciwciał skierowanych przeciwko wielu antygenom własnoustrojowym. Szczególnie istotne znaczenie diagnostyczne mają przeciwciała skierowane przeciwko różnym składnikom białkowym i niebiałkowym jądra komórkowego (antygeny jądrowe – dsDNA, ssDNA, histon, DNP, antygen Scl-70, białka cetromerowe) oraz antygenom białkowym, występującym w cytoplazmie, organellach komórkowych lub błonie komórkowej, zaangażowanym w procesy zainicjowane w jądrze komórkowym (białka rybosomalne, antygen Jo-I oraz inne aminoacylo tRNA-syntetazy) [8, 9]. Osobną grupę stanowią autoprzeciwciała skierowane przeciwko niektórym białkom surowiczym oraz komponentom tkanek, np. tkanki łącznej lub mięśniowej. Oznaczenie obecności oraz mian lub poziomów wyżej opisanych autoprzeciwciał przeciwko antygenom komórkowym wykonuje się zasadniczo z następujących powodów:
• obecność autoprzeciwciał może być patognomoniczna dla danej choroby,
• miano niektórych autoprzeciwciał odzwierciedla aktywność procesu chorobowego,
• obecność danego autoprzeciwciała koreluje z określonymi objawami klinicznymi,
• autoprzeciwciało ma znaczenie prognostyczne (rokownicze).
Obecnie w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej ok. 30 autoprzeciwciał ma z ww. powodów znaczenie diagnostyczne [9, 11, 12], a tylko kilkanaście z nich zakwalifikowano do kryteriów diagnostycznych danych jednostek jako tzw. przeciwciała markerowe [10]. Widać stąd jasno, jak wielkie znaczenie do postawienia prawidłowej diagnozy ma właściwe oznaczanie ich obecności i poziomu. Niestety, znaczenie diagnostyczne tylko niewielu autoprzeciwciał jest dobrze ustalone, a znaczenie pozostałych, zwłaszcza nowo odkrytych (np. przeciwciał dla keratyn), jest przedmiotem znacznych kontrowersji i wymaga dalszych badań [13, 14].
Aktualna sytuacja w serodiagnostyce autoprzeciwciał jest niezwykle skomplikowana, ponieważ z jednej strony dysponujemy coraz to większą liczbą nowych (czy nowo odkrytych) autoprzeciwciał, o jeszcze nie do końca ustalonym walorze diagnostycznym, a z drugiej strony coraz większą liczbą testów komercyjnych – o bardzo zróżnicowanej wartości diagnostycznej, która jest wynikiem różnorodności zastosowanych technik (metod oznaczania) oraz zróżnicowania zastosowanych antygenów (np. antygeny naturalne bądź rekombinantowe). Różnice (w wartości poszczególnych testów) wynikają też z takich parametrów, jak stopień natywności i oczyszczenia danego antygenu, ale także z czynników czysto technicznych, czyli np. z gęstości epitopów antygenu w teście ELISA na fazie stałej czy składu chemicznego zastosowanych mediów, np. siła jonowa diluentów, pH czy obecność detergentów.
Wykaz metod stosowanych dotychczas do oznaczania autoprzeciwciał jest także niezwykle bogaty i zaliczamy do niego takie metody, jak immunoelektroforeza, podwójna dyfuzja w żelach agarowych lub agarozowych, immunodyfuzja radialna, przeciwbieżna immunoelektroprecypitacja (tzw. metoda counter) oraz bardzo wiele metod tzw. immunoaglutynacyjnych [9, 15–18]. Wszystkie ww. metody, pomimo prostoty wykonania i braku konieczności posiadania skomplikowanej aparatury, mają określone niedomogi, a są nimi stosunkowo duża objętość i niestabilność preparatów antygenów wymaganych do odczynu, trudności w standaryzacji ww. metod oraz ich zbyt niska czułość. Całościowa i bardzo wnikliwa ocena tych metod została opublikowana w 1991 r. przez Reissa [18, 19].
Metoda IIF stosowana dzisiaj najczęściej w diagnostyce chorób z autoimmunizacją, m.in. do wykrywania przeciwciał dla antygenów jądrowych, wywodzi się w prostej linii od odczynów IF opracowanych przez Coonsa i wsp. [9] do wykrywania w tkankach antygenów wirusowych za pomocą swoistego przeciwciała związanego z fluorochromem (zwanego koniugatem) [16, 20].
Najnowszą i najwartościowszą modyfikacją, którą wypada omówić na zakończenie fragmentu dotyczącego metod IF (choć jest to metoda immunoenzymatyczna), jest tzw. metoda Colorzyme [16]. W tej metodzie wyeliminowano konieczność stosowania światła UV (do wzbudzenia fluorescencji, związanego z np. FITC koniugatu antyglobulinowego) przez zastosowanie koniugatów antyglobulin z peroksydazą chrzanową (HRP). Wprowadzony do metody Colorzyme nowy substrat dla peroksydazy 4-chloro-1-naftol, stosowany także do koniugatów z peroksydazą w metodzie Western-blotting, pozwala na zwiększenie czułości odczytu poprzez fakt, że metoda ta daje znaczne podniesienie możliwości rozróżnienia szczegółów struktur komórkowych (lub tkankowych) na obrazie mikroskopowym [20].
Technikami, które od połowy lat 80. wyparły wyżej opisane metody, są testy immunoenzymatyczne – wszelkie odmiany testu ELISA, technika Western-blotting oraz DOT-blot [21–24]. Obecnie dominującą pozycję wśród testów do wykrywania autoprzeciwciał zajmuje metoda ELISA, wykonywana na 96-dołkowych plastikowych, polietylenowych lub polipropylenowych płytkach titracyjnych, opłaszczonych wysoko oczyszczonymi preparatami antygenowymi.
Ogólna zasada racjonalnie prowadzonej serodiagnostyki sprowadza się do jej podziału na 3 (rzadko 4) zasadnicze etapy.
W 1. etapie powinno się ustalić, czy w danej surowicy (lub innym materiale biologicznym) występują w ogóle jakiekolwiek autoprzeciwciała z interesującego nas zakresu (np. przeciwciała przeciwjądrowe – ANA) oraz czy ich poziom przekracza ustaloną normę. Do tego etapu używa się zwykle testów przeglądowych (ang. screening tests) bazujących na substratach tkankowych (utrwalone przekroje narządów, np. wątroby, nerek ssaków) lub liniach komórkowych (komórki Hep-2), które z natury rzeczy są bogate w autoantygeny jądrowe, cytoplazmatyczne czy cytoszkieletowe [25]. Do użytku weszły też testy przeglądowe bazujące na metodzie immunoenzymatycznej ELISA, w których do spłaszczania powierzchni płytek titracyjnych używa się koktajlu wysoko oczyszczonych metodą chromatografii powinowactwa lub rekombinantowych antygenów jądrowych albo pełnego ekstraktu antygenów jądrowych (np. z określonego narządu, grasicy – RTE czy śledziony ssaków – BSE).
W 2. etapie ustalamy swoistość (lub najczęściej swoistości) autoprzeciwciała (oczywiście pod warunkiem, że test skryningowy, np. ANA-Hep-2, jest dodatni przy rozcieńczeniu badanej surowicy ≥1/100 – w przypadku dzieci i ≥1/320 u dorosłych). Metodami obecnie najczęściej stosowanymi są: metoda ELISA, Western-blotting lub DOT-blotting, gdzie konieczne jest już zastosowanie bardzo wysoko oczyszczonych preparatów antygenów jądrowych (lub antygenów rekombinantowych), by można było jednoznacznie stwierdzić, że w danej surowicy występuje (lub występują) autoprzeciwciała markerowe o określonej swoistości.
Oczywiście jest zrozumiałe, że w 2. etapie (tj. przy ustalaniu konkretnej swoistości autoprzeciwciała) korzystamy ze wskazówki, jaką jest określony typ (ang. pattern) świecenia w metodzie IIF lub wybarwiania jąder komórek Hep-2 w metodzie immunoperoksydazowej (Colorzyme), gdyż zawęża on zakres poszukiwanych swoistości autoprzeciwciał. Wynika to z lokalizacji określonych autoantygenów w strukturach komórki użytej jako substrat do testu i dlatego w np. przypadku tzw. plamistego typu świecenia (wybarwiania) jąder komórek Hep-2 należy poszukiwać przeciwciał dla antygenu U1-snRNP, Sm oraz SSA (Ro) i SSB (La) [8, 9, 19].
Etap 3. (zazwyczaj ostatni) sprowadza się do ustalenia, czy w danej surowicy występują autoprzeciwciała dla podtypów (ang. fine specificities) molekularnych danego autoantygenu (np. U1-snRNP-68 kD, A i C, Sm-BB’ czy D lub SSA-60 i 52 kD), ale następuje to tylko wtedy, gdy przeciwciała dla danego podtypu autoantygenu mają ewidentną asocjację kliniczną z określonym zespołem klinicznym (np. przeciwciała dla antygenu SSA--52 kD korelują z tzw. noworodkowym całkowitym blokiem serca) [9, 12].
Jednak w ok. 25–50% przypadków surowic pobranych od chorych reumatycznych wynik ANA jest ujemny i wtedy należy analizować również przeciwciała dla antygenów cytoplazmatycznych, do których należą m.in. przeciwciała dla antygenu Jo-I, rybosomalnego białka P, białek cytoszkieletu (cytokeratyna, aktyna, wimentyna), zwłaszcza przy objawach klinicznych wskazujących na określony typ schorzenia [26]. Należy też wziąć pod uwagę autoprzeciwciała z grupy przeciwciał antyfosfolipidowych (aPL), szczególnie przeciwciała antykardiolipinowe (aCl) oraz antykofaktorowe (anty-β2-GP-I, antyaneksyna V, anty-AT III, antyprotrombina itp.), cenne markery zespołu APS, często towarzyszącego chorobom reumatycznym [9, 15].
Etap 4. w typowaniu autoprzeciwciał jest konieczny tylko wtedy, gdy wyczerpaliśmy wszystkie możliwości diagnostyczne przeciwciał ANA oraz innych autoprzeciwciał markerowych i przy dodatnim odczynie ANA IIF czy techniką Colorzyme i konkretnym typie świecenia nie ustaliliśmy swoistości dostępnymi testami. Taka sytuacja, na szczęście dla diagnostów, zdarza się w ok. 1–5% przypadków i jest najczęściej z jednej strony wynikiem niezwykłego bogactwa odpowiedzi autoprzeciwciałowej w chorobach reumatycznych, z drugiej zaś strony stosunkowo niewielkiej liczby (rzędu 20) autoantygenów, dla których możemy oznaczyć autoprzeciwciała. Wykluczam oczywiście błędy techniczne, prowadzące do wyników fałszywie ujemnych, ale te nie powinny się zdarzyć przy prawidłowo prowadzonej diagnostyce. Wyjątkiem są tu zdarzające się, niestety, przypadki zubożenia epitopowego antygenów rekombinantowych, stosowanych w testach diagnostycznych. Rekomendowana przez ECSA (European Consensus Study on Autoantibodies) strategia kaskadowego ustalania swoistości przeciwciał ANA jest przedstawiona na ryc. 1. [27, 28].
Ta dysproporcja bogactwa odpowiedzi przeciwciał z jednej strony i stosunkowo ograniczonych możliwości diagnostycznych autoprzeciwciał z drugiej, zmusza do zastosowania w 4. etapie metodyki specjalnej – niestosowanej zwykle w diagnostyce rutynowej autoprzeciwciał, do której zaliczamy:
• zastosowanie wzorcowych przeciwciał monoklonalnych dla rzadkich antygenów na zwykle stosowanych substratach (np. komórki Hep-2),
• zastosowanie immunosorpcji surowic badanych wysoko oczyszczonymi antygenami (z użyciem rutynowych testów diagnostycznych),
• zastosowanie pełnych ekstraktów tkanek lub komórek Hep-2, MOLT4 czy innych, bogatszych w rzadkie antygeny w połączeniu z monoklonalnymi surowicami wzorcowymi.
Te specjalne procedury są zwykle stosowane w zakładach badawczych, dysponujących dużym doświadczeniem w serodiagnostyce autoprzeciwciał i zapleczem aparaturowym umożliwiającym otrzymywanie i oczyszczanie autoantygenów metodami chromatograficznymi. Z własnego doświadczenia autor stwierdza, że warto to robić, gdyż może to mieć (określone miejsce serodiagnostyki) znaczenie w diagnostyce różnicowej chorób reumatycznych, zwłaszcza w trudnych diagnostycznie przypadkach, i warto, by istniały zakłady, w których prowadzi się taką specjalistyczną diagnostykę [29–31].
Należy tylko wyrazić ubolewanie, że na ogół środki przeznaczone przez instytucje do tego powołane nie zapewniają możliwości utrzymania takich specjalistycznych zakładów diagnostycznych, prowadzących nierutynową identyfikację autoprzeciwciał.
Przestrzeganie wyżej opisanych procedur w większości przypadków badanych surowic daje możliwość ustalenia swoistości ANA i powtarzalności wyników, uniknięcia błędów diagnostycznych i – co nie mniej ważne – uzyskania rozsądnych kosztów prowadzonej diagnostyki. Coraz większa liczba nowo odkrytych autoprzeciwciał i metod diagnostycznych zmusza do wprowadzenia procedur standaryzacji zarówno metod, jak i testów, na których są oznaczane autoprzeciwciała.
Podsumowując, należy stwierdzić, że oznaczanie przeciwciał przeciwjądrowych jest metodą czułą, lecz nieswoistą. Tylko u chorych z objawami podmiotowymi czy przedmiotowymi chorób tkanki łącznej wykrycie ANA w mianach wyższych/równych niż 320
(a u dzieci od 1/100) może być pomocne w potwierdzeniu rozpoznania. Należy podkreślić, że przeciwciała mogą występować w różnych chorobach poza układowymi chorobami tkanki łącznej, np. w chorobach wątroby i płuc, we wszelkiego typu zakażeniach, w chorobach nowotworowych, skórnych i endokrynologicznych, a ponadto odsetek dodatnich ANA zwiększa się u kobiet w ciąży, u osób powyżej 60. roku życia, w zespołach polekowych oraz w stanach po przeszczepach (np. serca i nerek) [32]. U osób zdrowych (zwłaszcza powyżej 50.–60. roku życia) wyniki testu też bywają dodatnie. Badanie to nie powinno być zlecane pacjentom z niejasnymi dolegliwościami czy objawami, ponieważ z wyżej opisanych powodów wartość diagnostyczna tego oznaczenia jest znikoma. Wskazane jest natomiast u chorych z objawami układowej choroby tkanki łącznej, ponieważ tylko ustalenie obecności przeciwciała markerowego, tj. przeciwciała o wysokiej swoistości dla danej jednostki chorobowej, ma znaczenie pomocnicze dla diagnostyki różnicowej chorób reumatycznych, gdyż autoprzeciwciała markerowe są w kryteriach diagnostycznych większości chorób reumatycznych. Otrzymane tą drogą wyniki uzasadniają wówczas podjęcie dalszych badań mających na celu potwierdzenie rozpoznania [33].

Piśmiennictwo
1. Systemic Autoimmunity. Bigazzi PE, Reichlin M (eds.). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong 1991.
2. Organ-specific Autoimmunity. Bigazzi PE, Wick G, Wicher K (eds). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong, 1991.
3. Barnett LA, Fujinami RS. Molecular mimicry: a mechanism for autoimmune injury. FASEB J 1992; 6: 840-51.
4. Baum H, Butler P, Davies H, et al. Autoimmune disease and molecular mimicry: an hypothesis. Trends Biochem Sci 1993; 18: 140-5.
5. Horsfall AC. Molecular mimicry and autoantigens in conective tissue diseases. Mol Biol Rep 1992; 16: 139-43.
6. Ząbek J. Rola antygenów bakteryjnych w indukcji procesów autoimmunizacyjnych związanych z patogenezą reaktywnego zapalenia stawów. Alergia Astma Immunologia 1999; 4: 41-4.
7. Kontny E, Jesień-Dudzińska E, Romicka AM, et al. Immunologia chorób stawów. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza, Łódź 2000, 357-84.
8. Fritzler MJ. Immunofluorescent antinuclear antibody tests. Autoimmune Disease. In: Manual of Clinical Laboratory Immunology. Rose NR, Friedman H, Fahey JL (eds). American Society for Microbiology, Washinghton DC 1986: 733-9.
9. von Mühlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 1995; 24: 323-58.
10. Puszczewicz MJ. Przeciwciała przeciwjądrowe w diagnostyce różnicowej chorób układowych. Reumatologia 1998; 36: 30-41.
11. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooij WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London 1994.
12. Reichlin M. Systemic Lupus Erythematosus. In: Systemic Autoimmunity. Bigazzi PE, Reichlin M (eds). Mariel Dekller Inc., New York, Basel, Honkong, 1991: 163-99.
13. Vincent C, Serre G, Lapeyre F, et al. High diagnostic value in rheumatoid arthritis of antibodies to the stratum corneum of rat oesophagus epithelium, so-called “antikeratin-antibodies”. Ann Rheum Dis 1989; 48: 712-22.
14. Bąkowska A. Antikeratin antibodies in serum and in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis. Central European J Immunol 1999; 24: 25-9.
15. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). PWN, Warszawa, 1996.
16. Ząbek J. Metody wykrywania autoprzeciwciał „markerowych” w chorobach z autoimmunizacją. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza, Łódź 2000: 787-806.
17. Iwaszkiewicz J, Szkudlińska B. Metody oceny humoralnych składników odpowiedzi immunologicznej. W: Immunologia kliniczna. Kowalski ML (red.). Mediton Oficyna Wydawnicza, Łódź 2000: 749-64.
18. Reis J. Współczesne metody szybkiej indykacji i immunodiagnostyki rozpuszczalnych antygenów bakteryjnych. Post Mikrobiol 1989; 28: 17-34.
19. Manual of Clinical Laboratory Immunology. Rose NR, Friedman H, Fahey JL (eds). American Society for Microbiology. Washinghton DC 1986.
20. Manual of Biological Markers of Disease. van Venrooji WJ, Maini RN (eds). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 1994.
21. Engvall E, Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry 1971; 9: 871-6.
22. Gershoni JM, Poladi GE. Protein blotting: principles and applications. Anal Biochem 1983; 131: 1-34.
23. Grzybowski J, Trafny EA. Immunoenzyme test ELISA: classification and nomenclature. Post Hig Med Dośw 1985; 39: 440-9.
24. Ząbek J. Wykrywanie autoprzeciwciał występujących w surowicach chorych na układowe choroby tkanki łącznej z zastosowaniem techniki „immunoblotting”, czyli elektroforezy białek w żelu poliakrylamidowym połączonej z immunodetekcją. W: Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). PWN Warszawa, 1996: 101-12.
25. Cleymaet JE, Nakamura RM. Indirect immunofluorescent antinuclear antibody tests: comparison of sensitivity and specificity of different substrates. Am J Clin Pathol 1972; 58: 388-93.
26. Ząbek J. Nowoczesne metody wykrywania autoprzeciwciał markerowych oraz autoantygenów w chorobach reumatycznych. Reumatologia 1997; 35: 476-7.
27. van Venrooij WJ, Charles P, Maini RN. The consensus workshop for the detection of antibodies to intracellular antigens in rheumatic diseases. J Immunol Methods 1991; 140: 181-9.
28. Ząbek J. Consensus Workshop for Standardization of Autoantibodies to Intracellular Antigens. Second Meeting. Warszawa 29-30.04.1995. Reumatologia 1995; 33: 461-2.
29. Ząbek J. Nowoczesne metody wykrywania autoprzeciwciał
w chorobach z autoagresją. Przegl Epidemiol 2002; 56: 59-65.
30. Ząbek J. Przyczyny niepowodzeń w identyfikacji swoistości autoprzeciwciał ANA w surowicach pobranych od pacjentów
z układowymi chorobami tkanki łącznej. Reumatologia 2004; 42: 416-26.
31. Ząbek J, Palacz A, Musiej-Nowakowska E i wsp. Porównanie wartości diagnostycznej przeciwciał dla nukleosomów
z innymi markerami serologicznymi występującymi w toczniu rumieniowatym układowym. Reumatologia 2004; 42: 507-14.
32. Thomas C, Robinson JA. Oznaczanie przeciwciał przeciwjądrowych. Medycyna po Dyplomie 1994; 3: 114-8.
33. Hebanowski M, Bąkowska A. Komentarz. Medycyna po Dyplomie 1994; 3: 118-9.
Copyright: © 2005 Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji w Warszawie. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.





facebook linkedin twitter
© 2020 Termedia Sp. z o.o. All rights reserved.
Developed by Bentus.
PayU - płatności internetowe