en ENGLISH
eISSN: 2084-9834
ISSN: 0034-6233
Reumatologia/Rheumatology
Bieżący numer Archiwum Artykuły zaakceptowane O czasopiśmie Suplementy Rada naukowa Recenzenci Bazy indeksacyjne Prenumerata Kontakt
Panel Redakcyjny
Zgłaszanie i recenzowanie prac online
NOWOŚĆ
Portal dla reumatologów!
www.ereumatologia.pl
SCImago Journal & Country Rank


3/2005
vol. 43
 
Poleć ten artykuł:
Udostępnij:

Artykuł oryginalny/Original paper
Badania zmierzające do uwiarygodnienia wyników dodatnich w serodiagnostyce schorzeń układu ruchu o podejrzewanej etiologii bakteryjnej

Jacek Noworyta
,
Maria Brasse-Rumin
,
Jakub Ząbek

Ru 2005; 43, 3: 107-111
Data publikacji online: 2005/06/06
Plik artykułu:
- Badania zmierzające.pdf  [0.09 MB]
Pobierz cytowanie
 
 
Adres do korespondencji:
dr biol. Jacek Noworyta, Zakład Mikrobiologii i Serologii, Instytut Reumatologii im. prof. dr hab. med. E. Reicher, ul. Spartańska 1, 02-637 Warszawa
Praca wpłynęła: 16.11.2004 r.




Celem pracy było określenie stopnia wiarygodności uzyskiwanych wyników dodatnich w diagnostycznych badaniach serologicznych na obecność przeciwciał dla S. enteritidis i/lub S. typhimurium oraz Y. enterocolitica O3. Drobnoustroje te najczęściej łączone są z chorobami reumatycznymi o etiologii infekcyjnej (oprócz Ch. trachomatis ).
Grupę 96 surowic poddano absorpcji przeciwciał złożonymi antygenami ww. drobnoustrojów i zbadano odsetek zahamowania O.D. w metodzie ELISA.
W znacznym odsetku – 25% w przypadku przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 oraz 19% w przypadku Salmonella – nie udało się potwierdzić swoistości przeciwciał wykrywanych w badaniach rutynowych.
Porównanie potwierdzonych wyników serologicznych badań wstępnych z rozpoznaniami klinicznymi świadczyło o nie zawsze pewnym udziale tych drobnoustrojów w indukcji zdiagnozowanych chorób narządu ruchu i innych, niezróżnicowanych i układowych, a jedynie skłaniało do podejrzewania nadkażenia, oportunistycznej infekcji i bezobjawowego nosicielstwa.


The aim of the study was to establish degree of the validity for the positive results in serodiagnostics of the antibodies to S. enteritidis and/or S. typhimurium and Yersinia enterocolitica serotype O3. Generally these pathogens are associated with infectious pathomechanisms of the rheumatic diseases (with exception of Ch. trachomatis ).
The group of 96 sera were preadsorbed (or neutralized) with sorbents complexed with composed above mentioned bacterial antigenes and result of preadsorbtion was tested by using ELISA method.
In 25% of the adsorbed sera possessed antibodies to
Y. enterocolitica serotype O3 and in 19% anti-Salmonella positive sera the confirmation of the specificity was unsuccessful.
Comparison the initial of confirmed results serological tests (vs.) with clinical manifestations give us no proof for the involvement of the these microorganisms in the induction of diagnosed connective tissue diseases and other undifferentiated or systemic diseases, but lead us only to conclusion that we have to do with suprainfection, opportunistic infection or unmanifested bearering.




Wstęp
Serodiagnostyka bakteryjna [1, 6, 13, 14, 17–21, 24], nadal podstawowa w diagnozowaniu chorób układu ruchu o ewentualnej etiologii infekcyjnej, obarczona jest licznymi ograniczeniami [1, 5–7, 9, 12, 14–18, 21–23], z których zwłaszcza reakcje krzyżowe stanowią duży kłopot w ocenie wiarygodności uzyskanych wyników dodatnich. Często ma to negatywne implikacje terapeutyczne, wyrażone stosowaniem antybiotyków, powszechnie kwestionowanym i niezalecanym w leczeniu chorób reumatycznych [8, 10, 12, 18, 22, 25, 26].
Poprzednie prace tych samych autorów [4, 15–17] dobitnie podkreślały szeroką skalę występowania zjawiska krzyżowych reakcji serologicznych w odpowiedzi humoralnej zarówno na podstawowe w prawdopodobnej patogenezie spondyloartropatii drobnoustroje, takie jak Salmonella , Yersinia, Ch. trachomatis , jak i na wybrane złożone antygeny bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich oraz ich subkomponenty.
Celem pracy było zbadanie stopnia wiarygodności dodatnich wyników na obecność w surowicy pacjenta przeciwciał przeciwko Salmonella enteritidis i/lub
S. typhimurium oraz Yersinia enterocolitica O3.

Materiał i metody
Badaniom sprawdzającym swoistość (wiarygodność) uzyskanych wyników poddano 52 surowice dodatnie na obecność przeciwciał dla S. enteritidis i/lub
S. typhimurium oraz 44 surowice ze stwierdzonymi przeciwciałami dla Y. enterocolitica O3. Surowice pochodziły od pacjentów hospitalizowanych w Instytucie Reumatologii w latach 2001–2002, głównie w klinikach: Reumatologii Wieku Rozwojowego, Reumatologii, Chorób Tkanki Łącznej i Chorób Reumatycznych.
Zastosowano absorpcję surowic odpowiednimi antygenami całych bakterii i/lub złożonymi fragmentami ich ściany komórkowej (np. LPS, OMP – Outer Membrane Proteins, ECA – Enterobacteriaceae Common Antigen) i badano odsetek zahamowania poziomu przeciwciał w metodzie ELISA, świadczący o wiarygodności uprzednio uzyskanych wyników.
W przypadku surowic salmonellowych, absorpcji przeciwciał dokonywano przy zastosowaniu antygenów całych bakterii (suchy proszek acetonowy), LPS i OMP odpowiedniego gatunku Salmonella . Co do surowic yersiniowych absorpcji przeciwciał dokonywano przy użyciu całych bakterii Y. enterocolitica O3, OMP oraz jako kontroli – ECA. Zródło pochodzenia lub procedura uzyskania antygenów zostały uprzednio opisane [15].

Metoda wykonania absorpcji przeciwciał w surowicach [11]
Surowice inkubowano z odpowiednimi antygenami w stężeniu 200 µg/dołek płytki titracyjnej – przez 1 godz. w temp. 37oC i 1 godz. w temperaturze pokojowej. Następnie dokonywano pomiaru poziomu przeciwciał odpowiednio takich samych, jak w badaniach rutynowych [15]. Stopień absorpcji (zahamowanie w procentach) oceniano wg Aoki i wsp. [2], stosując iloraz 100 – (/100 x O.D. ELISA w obecności antygenu absorpcyjnego/O.D. bez obecności antygenu).
Odsetki zahamowania metodą ELISA ≥50% w dużej mierze mogłyby wskazywać na swoistość odpowiedzi humoralnej i taka, chociaż subiektywna, ocena została uwzględniona jako kryterium wiarygodności uzyskanych wyników dodatnich w badaniach rutynowych.
Dwie grupy surowic pobranych od pacjentów ze znanymi rozpoznaniami posłużyły w badaniach nad ewentualną korelacją między wiarygodnością (swoistością) uzyskanego dodatniego wyniku na obecność przeciwciał dla ww. gatunków Salmonella i Yersinia a jednostką chorobową często związaną (opisywaną) z infekcjami (np. reaktywne zapalenie stawów – ReZS, łuszczycowe zapalenie stawów – ŁZS, niezróżnicowane zapalenie stawów) i bez tego związku (np. choroba Scheuermana, choroba zwyrodnieniowa stawów).
Jedna grupa surowic (23 surowice) z dodatnimi wynikami na obecność przeciwciał dla S. enteritidis i/lub
S. typhimurium zawierała następujące najliczniejsze rozpoznania: młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (MIZS) – 5, reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) – 4 i niesklasyfikowane zapalenie stawów – 3.
Druga grupa surowic (28 surowic) z dodatnimi wynikami przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 to grupa pacjentów m.in. z MIZS – 9, ReZS – 5 i zesztywniającym zapaleniem stawów kręgosłupa (ZZSK) – 3.

Wyniki
Pierwszy etap pracy dotyczył badań zmierzających do wykazania wiarygodności uzyskanych wyników na obecność w surowicach przeciwciał dla S. enteritidis i/lub S. typhimurium oraz Y. enterocolitica O3. Rutynowe badania metodą ELISA dały wyniki pozytywne z zastosowaniem antygenów LPS odpowiedniego gatunku drobnoustroju. W przypadku LPS S. enteritidis i/lub
S. typhimurium był to antygen firmowy (Sigma), natomiast LPS Y. enterocolitica O3 został uzyskany i oczyszczony wg procedury cytowanej poprzednio [15].
Wyniki przedstawione w tab. I wskazują na dość wysoki, wyrównany odsetek (ok. 60–90%) surowic, w których udało się – drogą absorpcji – uzyskać potwierdzenie dodatnich wyników na obecność przeciwciał (niezależnie od ich klasy) dla S. enteritidis i/lub S. typhimurium . Zdecydowanie – in minus – odbiegały tutaj rezultaty z użyciem do absorpcji antygenu LPS S. typhimurium . Aż w 75% surowic nie potwierdzono zatem wyniku dodatniego, uzyskanego w badaniu diagnostycznym w przypadku tego drobnoustroju.
Szczegółowa analiza wyników poszczególnych surowic dotyczących obecności przeciwciał dla Salmonella (głównie S. enteritidis) pozwoliła z dużym prawdopodobieństwem (80,1%) potwierdzić rezultat dodatni uzyskany w badaniach rutynowych.
Nieco inne wyniki (tab. II) stwierdzono w badaniach nad zahamowaniem reakcji w metodzie ELISA w przypadku przeciwciał dla Y. enterocolitica O3. Tutaj – spośród mniejszej liczby użytych antygenów złożonych – wyróżniał się antygen całych bakterii, który silnie i często absorbował przeciwciała surowicze dla LPS tego serotypu Yersinia (aż w 87,8% surowic). Z niską częstością czyniły to antygeny całych bakterii i OMP w stosunku do ewentualnych przeciwciał OMP (10–21% surowic). Widocznie przeciwciała dla tych złożonych białek zewnętrznej części ściany komórkowej Y. enterocolitica O3 występowały rzadko. Ogólnie – w przypadku tego drobnoustroju – w 75% surowic potwierdzono dodatni wynik na obecność swoistych przeciwciał.
Spośród wszystkich badanych surowic wyodrębniono 2 grupy ze znanymi rozpoznaniami klinicznymi. Podobnie różniły się one obecnością przeciwciał dla S. enteritidis i/lub S. typhimurium (24 surowice) oraz dla
Y. enterocolitica O3 (28 surowic), stwierdzonymi w rutynowych badaniach diagnostycznych. Ich szczegółowa analiza pod kątem zahamowania metody ELISA poprzez absorpcję przeciwciał odpowiednimi antygenami pozwoliła na dokonanie następujących spostrzeżeń:
• wśród surowic ze znanymi rozpoznaniami i stwierdzoną w badaniach rutynowych obecnością przeciwciał dla Salmonella wykazano w 75% potwierdzenie swoistości przeciwciałowej, w tym 71,4% w grupie z chorobami narządu ruchu (m.in. w 3 przypadkach na 5 – MIZS, w 4/4 – RZS, ale w 0/1 zdiagnozowanym ReZS),
• w grupie surowic ze znanymi rozpoznaniami klinicznymi i obecnością przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 stwierdzono nieco niższą (67,8%) swoistość przeciwciałową, w tym w grupie osób z chorobami narządu ruchu – 65% swoistość (m.in. w 4 przypadkach na 9 – MIZS, w 5 na 5 – ReZS i 1 na 3 – ZZSK),
• w grupie chorych z objawami pozastawowymi analogicznie wykazano swoistość przeciwciałową dla Salmonella w 80% przypadków i 75% dla Y. enterocolitica O3.

Kolejna analiza uzyskanych wyników badań dotyczyła potwierdzenia przeciwciał poszczególnych klas Ig i wykazała (tab. III):
• nieporównywalność rezultatów odnośnie do przeciwciał klasy IgA (z uwagi na rzadkość stwierdzanych przeciwciał tej klasy),
• zbliżony (ok. 60%) odsetek potwierdzonych przeciwciał klasy IgG dla LPS obu rodzajów drobnoustrojów,
• znaczne różnice w przypadku przeciwciał IgM dla Salmonella (36,6% potwierdzonych przypadków) i Y. enterocolitica O3 (80%).

Dyskusja
Biorąc pod uwagę fakt, że oznaczanie przeciwciał antybakteryjnych – mimo swoich wad i ograniczeń – jest szeroko stosowane w diagnostyce chorób narządu ruchu o podejrzewanej etiologii infekcyjnej (np. cała grupa spondyloartropatii), uzyskane wyniki dotyczące potwierdzenia wiarygodności obecności swoistych przeciwciał napawają niepokojem. Z uwagi na rozpowszechnione zjawisko występowania krzyżowych reakcji serologicznych, wykazane m.in. przez cytowanych autorów [4, 15–17] i aktualne dane świadczące o potwierdzeniu wyników dodatnich jedynie w 75% przypadków odnośnie do przeciwciał dla Y. enterocolitica O3 i w 80% w przypadku S. enteritidis i/lub S. typhimurium , nasuwają się wnioski wskazujące na to, jak istotna jest właściwa ocena kliniczna (objawy, retrospektywny wywiad, parametry zapalne itp.) każdego chorego ze stwierdzoną obecnością takich przeciwciał. Równie ważne jest badanie dynamiki i właściwa ocena poziomu i klasy wykrywanych przeciwciał. Wymagana jest także teoretyczna wiedza klinicysty na temat skomplikowanych zjawisk towarzyszących m.in. odpowiedzi humoralnej.
Niepoślednią rolę w prawidłowej ocenie uzyskanego wyniku odgrywa metoda serologiczna użyta w badaniach rutynowych z zastosowaniem odpowiedniego swoistego, wysoce oczyszczonego antygenu bakteryjnego w metodzie ELISA. O ile w przypadku diagnostyki serologicznej Ch. trachomatis i/lub Ch. pneumoniae takie sprecyzowane antygeny stosuje się coraz częściej na szeroką skalę [3], o tyle w przypadku aktualnie badanych drobnoustrojów (Salmonella i Yersinia) w dalszym ciągu metody immunoenzymatyczne oparte są na wykrywaniu przeciwciał dla antygenów złożonych (np. całe bakterie, SDS-
-ekstrakty, LPS, OMP). Predysponuje to do wystąpienia reakcji krzyżowych. Wynika to z faktu, że metody te z reguły opracowywane są przez poszczególne placówki (laboratoria), firmy światowe bowiem nie interesują się tego typu diagnostyką z uwagi na brak tzw. konsumentów. Taka diagnostyka jest ograniczana świadomie, w związku z występowaniem ogromnej liczby gatunków Salmonella , albo wynika z niedoceniania patogennej roli Yersinia. Siłą rzeczy metody tego typu mają znaczenie głównie skryningowe. Na niepewność uzyskanych dodatnich wyników serologicznych wpływa też wysoka czułość metod immunoenzymatycznych.
To wszystko sprawia, że zwłaszcza słabo dodatni (wątpliwy) wynik odważnie zinterpretowany przez klinicystę reumatologa może skłonić go nawet do niepewnego (a wręcz błędnego) zdiagnozowania jednostki chorobowej, czego implikacją jest długotrwała, nieskuteczna i droga terapia, która często może być nazywana leczeniem przeciwciał, i to nieswoistych.
Na podstawie badań w toku niniejszej pracy można było przypuszczać, że ok. 20–25% wyników dodatnich na obecność przeciwciał dla S. enteritidis i/lub S. typhimurium oraz Y. enterocolitica O3 mogło być obarczone tą niepewnością. Stosowany w naszych badaniach rutynowych antygen LPS był różnego pochodzenia (wysoce oczyszczony LPS Salmonella firmy Sigma oraz uzyskany i oczyszczony we własnym zakresie LPS Y. enterocolitica O3). Być może już ten fakt spowodował nieznaczne różnice w odsetku potwierdzonych dodatnich wyników na obecność swoistych przeciwciał na korzyść salmonellowych (80 vs 75% dla Y. enterocolitica O3). Zwłaszcza duże różnice w swoistej absorpcji przeciwciał stwierdzono stosując LPS (firmowy) obu badanych gatunków drobnoustrojów, potwierdzając w 73,7% surowic obecność przeciwciał dla S. enteritidis, a zaledwie w 25% dla S. typhimurium (tab. I). Jest to logiczne (choć nie w takim stopniu); badania populacyjne wskazują bowiem na dominację S. enteritidis.
Szczegółowa analiza uzyskanych wyników wykazała też wysoki odsetek surowic z potwierdzoną obecnością przeciwciał dla OMP (zwłaszcza S. enteritidis) – 88%, który to składnik ściany komórkowej jest strukturalnie związany z LPS.
Stosując również absorpcję przeciwciał salmonellowych przy użyciu wieloepitopowego antygenu całych bakterii obu gatunków, wykazano ok. 60% obecność przeciwciał dla LPS, wyrażającą się silnym zahamowaniem metody ELISA.
U jeszcze większego odsetka surowic (ok. 88%) wykazano (tab. II) absorpcję przeciwciał dla LPS Y. enterocolitica O3 przez preparat antygenowy całych bakterii, a w metodzie ELISA, stosując LPS tego drobnoustroju. Być może wynika to z faktu, że epitopy LPS, znajdujące się na zewnątrz ściany komórkowej, w odróżnieniu od OMP, zdecydowanie łatwiej absorbują znajdujące się w surowicach swoiste przeciwciała dla tego składnika (wysoce immunogennego). Świadczyłyby o tym wyniki, wskazujące na zdecydowanie mniejszy odsetek (10–21%) surowic z obecnością swoistych przeciwciał dla OMP Y. enterocolitica O3, co wykazano, stosując jako absorbent całe bakterie tego drobnoustroju oraz preparat jego OMP.
Ogólnie wyniki wskazują, że w dość znacznym odsetku (20–25%) serologiczne badania rutynowe mogą być obarczone brakiem wiarygodności co do swoistości wykrywanych przeciwciał dla obu rodzajów i/lub gatunków drobnoustrojów. Dodatkowo dowodzą tego niepotwierdzone wysokie odsetki przeciwciał różnych klas (IgG, IgM), jak również brak różnic w stopniu potwierdzenia swoistości przeciwciał między grupą chorób narządu ruchu o podejrzewanej etiologii infekcyjnej (np. spondyloartropatie) a pozostałymi, w tym typowo układowymi.
Uzyskane wyniki nie stanowią silnego argumentu dla podkreślania roli wykrywanych przeciwciał w etiopatogenezie niektórych chorób układu ruchu, a na pewno nie w każdym przypadku ich wykrycia, zwłaszcza bez potwierdzenia swoistości. Sugeruje to również konieczność wnikliwej analizy klinicznej i korelacji z dynamiką indukowanych przeciwciał, które mogą wskazywać na istotność uzyskanych dodatnich wyników serologicznych, jak również być skutkiem bezobjawowego nosicielstwa (zwłaszcza Salmonella ), oportunistycznej infekcji czy wreszcie nadkażenia.

Praca sfinansowana z grantu KBN nr 3PO5B 015 23.


Piśmiennictwo

1. Ahmadi K, Wilson C, Tiwana H, et al. Antibodies to Klebsiella pneumoniae lipopolysaccharide in patients with ankylosing spondylitis. Br J Rheumatol 1998; 37: 1330-3.
2. Aoki S, Yoshikawa K, Yokoyama T, et al. Role of enteric bacteria in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: evidence for antibodies to enterobacterial common antigens in rheumatoid sera and synovial fluids. Ann Rheum Dis 1996; 55: 363-9.
3. Bas S, Vischer TL. Chlamydia trachomatis antibody detection and diagnosis of reactive arthritis. Br J Rheumatol 1998; 37: 1054-9.
4. Brasse-Rumin M, Noworyta J, Ząbek J. Reumatologia 2004; 42: 31.
5. Braun J, Kingsley G, van der Heijde D, et al. On the difficulties of establishing a consensus on the definition and diagnostic investigations for reactive arthritis. Results and discussion of a questionnaire prepared for the 4th International Workshop on Reactive Arthritis, Berlin, Germany, July 3-6, 1999.
J Rheumatol 2000; 27: 2185-92.
6. Fendler C, Laitko S, Sorensen H, et al. Frequency of triggering bacteria in patients with reactive arthritis and undifferentiated oligoarthritis and the relative importance of the tests used for diagnosis. Ann Rheum Dis 2001; 60: 337-43.
7. Granfors K, Toivanen A. ELISA and RIA for serologic diagnosis of yersiniosis. Rev Infect Dis 1984; 6: 421-4.
8. Hannu T, Mattila L, Siitonen A, el al. Reactive arthritis following an outbreak of Salmonella typhimurium phage type 193 infection. Ann Rheum Dis 2002; 61: 264-6.
9. Hill HR, Matsen JM. Enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay in the serologic diagnosis of infectious diseases. J Infect Dis 1983; 147: 258-63.
10. Hoogkamp-Korstanje JA, Moesker H, Bruyn GA. Ciprofloxacin v placebo for treatment of Yersinia enterocolitica triggered reactive arthritis. Ann Rheum Dis 2000; 59: 914-7.
11. Isomaki O, Vuento R, Granfors K. Serological diagnosis of Salmonella infections by enzyme immunoassay. Lancet 1989; 1: 1411-4.
12. Kingsley G, Sieper J. Third International Workshop on Reactive Arthritis. 23-26 September 1995, Berlin, Germany. Report and abstracts. Ann Rheum Dis 1996; 55: 564-84.
13. Maki-Ikola O. Salmonella -triggered reactive arthritis, Department of Medical Microbiology, Turku University, Finland Academic Dissertation Turku 1991.
14. Maki-Ikola O, Lehtinen K, Nissila M, et al. IgM, IgA and IgG class serum antibodies against Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli lipopolysaccharides in patients with ankylosing spondylitis. Br J Rheumatol 1994; 33: 1025-9.
15. Noworyta J, Ząbek J, Brasse-Rumin M i wsp. Reumatologia 2003; 41: 259.
16. Noworyta J, Ząbek J, Brasse-Rumin M. i wsp. Reumatologia 1999; 37: 343.
17. Noworyta J, Ząbek J, Brasse-Rumin M i wsp. Reumatologia 2001; 39: 29.
18. Sieper J, Braun J, Kingsley GH. Report on the Fourth International Workshop on Reactive Arthritis. Arthr Rheum 2000; 43: 720-34.
19. Sobieszczańska BA i wsp. Reumatologia 1997; 35: 62.
20. Sobieszczańska BA i wsp. Reumatologia 1997; 35: 138.
21. Świerkot J i wsp.: Pol Arch Med Wewn 2003; 110, 1: 711.
22. Świerkot J, Marczyńska-Gruszecka K, Szechiński J. Post Hig Med Dośw 2003; 57: 171.
23. Wollenhaupt J, Schnarr S, Kuipers JG. Bacterial antigens in reactive arthritis and spondarthritis. Rational use of laboratory testing in diagnosis and follow-up. Baillieres Clin Rheumatol 1998; 12: 627-47.
24. Ząbek J, Brzezicki J, Noworyta J i wsp. Reumatologia 2000; 38: 416.
25. Yli-Kerttula T, Luukkainen R, Yli-Kerttula U. Effect of a three month course of ciprofloxacin on the outcome of reactive arthritis. Ann Rheum Dis 2000; 59: 565-70.
26. Yli-Kerttula T, Luukkainen R, Yli-Kerttula U, et al. Effect of a three month course of ciprofloxacin on the late prognosis of reactive arthritis. Ann Rheum Dis 2003; 62: 880-4.
Copyright: © 2005 Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji w Warszawie. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.



© 2024 Termedia Sp. z o.o.
Developed by Bentus.