Artykuł oryginalny
Zmiany w kości długiej w nowym eksperymentalnym modelu osteomyelitis aseptica chronica u szczurów

Wstęp i cel pracy
Podstawowa eksperymentalna metoda wywoływania stanu zapalnego kości i szpiku kostnego (osteomyelitis) polega na wprowadzeniu bakterii do organizmu zwierzęcia, najczęściej bezpośrednio do jamy szpikowej kości [1–6]. Jednak metoda ta nie może być wykorzystana w celu oceny zmian w tkance kostnej i szpiku kostnym w wypadkach jałowego osteomyelitis, które u ludzi występuje jako powikłanie powtarzających się urazów kości, szkodliwego wpływu promieni jonizujących albo zatrucia fosforem. Od niedawna próbuje się również wykorzystać do badań myszy CMO (chronic multifocal osteomyelitis) z uwarunkowanym genetycznie przewlekłym nawracającym wieloogniskowym zapaleniem kości i szpiku kostnego [7]. Zmiany w tkance kostnej u myszy CMO wymagają obecnie dalszych badań, ponieważ nie udowodniono jednoznacznie, czy odpowiadają one osteomyelitis obserwowanemu u ludzi. Dotychczas znane metody badania osteomyelitis u zwierząt mają ww. ograniczenia metodyczne, dlatego autorka niniejszej pracy założyła opracowanie nowego modelu eksperymentalnego. W tym celu wykorzystała metodę wywołania stanu zapalnego, opisaną przez Meiera i wsp., w modyfikacji własnej. Metoda opracowana przez Meiera i wsp. polegała na wprowadzeniu do tkanki podskórnej implantu jałowej peletki bawełnianej w celu wywołania stanu zapalnego w tej tkance [8]. Modyfikacja własna autorki to zastosowanie jałowej peletki bawełnianej nie w tkance podskórnej, lecz w jamie szpikowej kości długiej, w celu doprowadzenia do stanu zapalnego kości i jamy szpikowej [9]. Mimo że w wyniku implantacji peletki uzyskano osteomyelitis, autorka stwierdziła, że ujemną stroną tej metody jest fakt zatykania jamy szpikowej przez peletkę. Z tego powodu w dalszych etapach badań autorka udoskonaliła metodę i zamiast peletki w jamie szpikowej kości udowej zastosowała implant jałowej nitki bawełnianej. Nitka była przeciągnięta przez całą długość kości, a drożność jamy szpikowej została zachowana. Dzięki zastosowaniu u szczurów przez tydzień nitki jako implantu uzyskano zmiany w tkance kostnej oraz zmiany hematologiczne szpiku kostnego, które świadczyły o toczącym się ostrym stanie zapalnym kości i szpiku kostnego (osteomyelitis aseptica acuta) [10]. Autorka założyła więc, że model eksperymentalny z zastosowaniem nitki może być pomocny w ocenie patofizjologii osteomyelitis oraz może przyczynić się do opracowania właściwej farmakoterapii tego procesu chorobowego. Opierając się na wynikach uzyskanych w ww. modelu osteomyelitis aseptica acuta, w niniejszej pracy zastosowano implant jałowej nitki bawełnianej w jamie szpikowej kości udowej przez okres dłuższy, a więc przez 3 i 6 tyg., w celu wywołania przewlekłego jałowego zapalenia kości i jamy szpikowej – osteomyelitis aseptica chronica.
Materiał i metody
Badania zostały wykonane na szczurach za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Katowicach (nr zezwolenia 8/03), zgodnie z obowiązującymi standardami bioetycznymi. Badania przeprowadzono na szczurach samcach szczepu Wistar (260–270 g), które podzielono na 4 grupy:
I Grupa K-3 (n=6) – szczury kontrolne w eksperymencie 3-tygodniowym, u których wykonano zabieg pozorny.
II Grupa K-6 (n=6) – szczury kontrolne w eksperymencie 6-tygodniowym, u których wykonano zabieg pozorny.
III Grupa B-3 (n=6-8) – szczury, u których dokonano implantacji jałowej nitki bawełnianej do jamy szpikowej kości udowej prawej na 3 tyg.
IV Grupa B-6 (n=6-8) – szczury, u których dokonano implantacji jałowej nitki bawełnianej do jamy szpikowej kości udowej prawej na 6 tyg.
Wykonanie zabiegu implantacji jałowej nitki bawełnianej do jamy szpikowej kości udowej u szczurów
W celu wywołania jałowego stanu zapalnego jamy szpikowej zastosowano metodę opisaną przez Meiera i wsp. [8], w modyfikacji własnej [10]. Meier i wsp. stosowali implant jałowej peletki bawełnianej w celu wywołania jałowego stanu zapalnego w tkance podskórnej, natomiast modyfikacja własna polegała na zastosowaniu jałowej nitki bawełnianej w jamie szpikowej kości długiej. U szczurów grup B-3 i B-6, uśpionych metoheksytalem (100 mg/kg m.c. i.p.) w celu implantacji jałowej nitki bawełnianej, odsłaniano trzon kości udowej prawej i na powierzchni bocznej przylegającej do mięśnia prostownika wywiercano 2 otwory o średnicy 1,4 mm (pierwszy w okolicy nasady bliższej, pomiędzy krętarzem mniejszym a krętarzem trzecim; drugi otwór w okolicy nasady dalszej). Nitka o długości 2 cm była przeciągnięta pomiędzy otworami w jamie szpikowej kości udowej. Następnie otwory w trzonie kości udowej zostały wypełnione cementem fosforanowym, a mięśnie i skóra zwierzęcia zostały zszyte. Aby zachować podobne warunki narkozy i inwazji do jamy szpikowej, u zwierząt z grup kontrolnych K-3 i K-6 przeprowadzono pozorny zabieg, polegający na odsłonięciu trzonu kości udowej prawej, wywierceniu otworów (bez wprowadzania nitki), a następnie wypełnieniu otworów cementem fosforanowym i zszyciu mięśni i skóry. Po 3 (grupa K-3 i B-3) lub 6 tyg. (grupa K-6 lub B-6) od wykonania zabiegu operacyjnego zwierzęta wykorzystano do:
1) badania przyrostu masy ciała oraz masy śledziony i grasicy,
2) badań hematologicznych krwi obwodowej i szpiku kostnego,
3) badań morfometrycznych kości.
Badania hematologiczne krwi obwodowej
Bezpośrednio przed wykonaniem zabiegu operacyjnego na kości oraz 3 lub 6 tyg. po zabiegu operacyjnym na kości udowej prawej we wszystkich grupach pobierano krew z ogona zwierząt i wykonano następujące oznaczenia hematologiczne: liczby krwinek czerwonych, liczby krwinek białych, wskaźnika hematokrytu, ilości hemoglobiny oraz wyznaczono procentową zawartość krwinek białych w rozmazie krwi obwodowej. Rozmaz krwi obwodowej był barwiony metodą May, Grünwalda i Giemsy (MGG).
Badania hematologiczne szpiku kostnego
Po 3 lub 6 tyg. od wykonania zabiegu operacyjnego na kości udowej prawej, po uprzednim uśpieniu zwierząt, odsłaniano trzon kości udowej prawej i trzon kości udowej lewej, a następnie wykonano w nich otwór wg metody opisanej powyżej (u szczurów grup B-3 i B-6 dodatkowo wyciągnięto nitkę). Po sporządzeniu rozmazu szpiku kostnego wyznaczono jego procentowy wzór leukocytarny. Rozmaz szpiku kostnego był barwiony metodą MGG.
Badania morfometryczne kości
Po uśmierceniu zwierząt w grupie K-3 i K-6 izolowano kości udowe prawe (pozornie operowane) i lewe (nieoperowane), a w grupach B-3 i B-6 kości udowe prawe (które przed zabiciem zwierząt zawierały implant) oraz kości udowe lewe (nieoperowane). We wszystkich grupach zwierząt wypreparowano również kości piszczelowe prawe. Pomiary makrometryczne kości obejmowały oznaczenia: masy kości udowych i kości piszczelowej, długości kości udowych i kości piszczelowej, średnicy trzonu kości udowych i kości piszczelowej (mierzonych w płaszczyźnie czołowej i w płaszczyźnie strzałkowej w połowie długości kości), średnicy nasady dalszej kości udowych (mierzonej w płaszczyźnie czołowej i w płaszczyźnie strzałkowej), średnicy nasady bliższej kości piszczelowej (mierzonej w płaszczyźnie czołowej i strzałkowej). Kości udowe zostały wykorzystane również do sporządzenia preparatów histologicznych. Uzyskane skrawki preparatów histologicznych, po oszlifowaniu i utrwaleniu w 99,8% alkoholu etylowym, barwiono metodą Tripp i MacKaya [11], stosując zmodyfikowane czasy barwienia. Preparaty przekroju poprzecznego (prostopadłe do osi długiej kości) uzyskano z 3 miejsc kości udowej: od strony nasady bliższej, w połowie długości kości i od strony nasady dalszej [10]. Pomiary histometryczne przekroju poprzecznego kości udowych obejmowały oznaczenia: pola całkowitej powierzchni trzonu oraz powierzchni jamy szpikowej kości, grubości osteoidu zewnętrznego (od strony periosteum) i wewnętrznego (od strony endosteum) kości oraz przyrostu zewnętrznego (od strony periosteum) i wewnętrznego (od strony endosteum) na grubość kości z wykorzystaniem metody tetracyklinowej [12]. W tym celu 24 godz. przed rozpoczęciem eksperymentu i 24 godz. przed zakończeniem badań podawano chlorowodorek tetracykliny w dawce 20 mg/kg m.c. i.p. Tetracyklina jest markerem w badaniach histomorfometrycznych przyrostu kości. W preparacie przekroju podłużnego nasady dalszej kości udowych oznaczano szerokość beleczek kostnych oraz szerokość chrząstki nasadowej. Analiza histomorfometryczna preparatów histologicznych została przeprowadzona z wykorzystaniem mikroskopu sprzężonego z kamerą i komputerem, przy użyciu oprogramowania Lucia G, służącego do cyfrowych pomiarów histologicznych.
Statystyczne opracowanie uzyskanych wyników
Analizy statystycznej dokonano za pomocą testu t-Studenta. Wyniki przedstawiono w postaci średniej arytmetycznej ± średni błąd średniej arytmetycznej. W opracowaniu statystycznym wyników badań hematologicznych szpiku kostnego oraz badań histomorfometrycznych kości porównywano:
1) wyniki z kości udowych prawych (pozornie operowanych) grupy K-3 lub K-6 z wynikami z kości udowych lewych (nieoperowanych) tej samej grupy,
2) wyniki z kości udowych prawych (na których wykonano zabieg implantacji nitki) grupy B-3 lub B-6 z wynikami z kości udowych prawych (pozornie operowanych) odpowiedniej grupy kontrolnej K-3 lub K-6,
3) wyniki z kości udowych lewych (nieoperowanych) grupy B-3 lub B-6 z wynikami z kości udowych lewych (nieoperowanych) odpowiedniej grupy kontrolnej K-3 lub K-6.
Wyniki
Oznaczenia masy ciała zwierząt oraz masy narządów
U zwierząt z grupy kontrolnej K-3 po 3 tyg. trwania eksperymentu przyrost masy ciała wynosił 69,20±2,82 g, a w grupie kontrolnej K-6 po 6 tyg. eksperymentu przyrost masy ciała wynosił 126,33±3,30 g. W grupie szczurów, u których wykonano zabieg implantacji nitki bawełnianej do kości na 3 tyg. (grupa B-3), przyrost masy ciała był mniejszy niż w grupie K-3 o 7,87%, a u szczurów, u których implant znajdował się w kości przez 6 tyg. (grupa B-6), przyrost masy ciała był statystycznie istotnie mniejszy (p <0,005) o 35,68% niż w grupie kontrolnej K-6. U szczurów z grupy K-3 masa śledziony i masa grasicy wynosiły odpowiednio 0,63±0,04 g i 0,26±0,02 g, a w grupie K-6 odpowiednio 0,71±0,02 g i 0,27±0,02 g. W grupie szczurów B-3 masa badanych narządów była taka jak w grupie K-3, natomiast u zwierząt z grupy B-6 masa śledziony była statystycznie istotnie większa (p <0,005) o 15,58% w porównaniu ze szczurami z grupy K-6, a masa grasicy była podobna do wyniku uzyskanego w grupie K-6.
Oznaczenia hematologiczne krwi obwodowej
Wyniki oznaczeń hematologicznych krwi obwodowej: liczby erytrocytów, leukocytów, hemoglobiny i wskaźnika hematokrytu w grupach szczurów kontrolnych K-3 i K-6 oraz u szczurów z grup z implantem w kości B-3 i B-6 przedstawiono w tab. I. Po 3 tyg. od zabiegu implantacji w grupie B-3 liczba erytrocytów zmniejszyła się o 15,87%, stężenie hemoglobiny było statystycznie istotnie mniejsze (p <0,05) o 38,68%, a hematokryt był mniejszy o 7,14% w porównaniu z wynikami uzyskanymi w tej grupie szczurów przed eksperymentem. W grupie B-6 liczba erytrocytów była statystycznie istotnie mniejsza (p <0,005) o 31,13%, stężenie hemoglobiny było statystycznie istotnie mniejsze (p <0,005) o 57,85%, a hematokryt był statystycznie istotnie mniejszy (p <0,05) o 10,59% w porównaniu z wynikami uzyskanymi w tej grupie szczurów przed eksperymentem. Procentowa zawartość krwinek białych w rozmazie krwi obwodowej w grupie K-3 przed eksperymentem wynosiła: 5,16±0,46 granulocytów obojętnochłonnych pałeczkowatych, 1,99±0,24 granulocytów kwasochłonnych pałeczkowatych, 0,05±0,05 granulocytów zasadochłonnych pałeczkowatych, 29,22±1,33 granulocytów obojętnochłonnych, 2,33±0,23 granulocytów kwasochłonnych, 0,88±0,14 granulocytów zasadochłonnych, 60,49±0,54 limfocytów, 0,66±0,12 monocytów i nie różniła się od wyniku uzyskanego w tej grupie po 3 tyg. eksperymentu. U szczurów z grup K-6, B-3 i B-6 procentowa zawartość krwinek białych w rozmazie krwi obwodowej zarówno przed eksperymentem, jak i po nim była taka jak w grupie K-3.
Oznaczenia hematologiczne szpiku kostnego
Wyniki oznaczeń hematologicznych szpiku kostnego są przedstawione w tab. II. Układ erytroblastyczny, oznaczony na podstawie preparatów uzyskanych z kości pozornie operowanej grupy K-3 i K-6, stanowił odpowiednio 35,91% i 37,15% komórek szpiku kostnego. Zawartość komórek układu erytroblastycznego szpiku kostnego kości zawierającej implant w grupie B-3 uległa statystycznie istotnemu zmniejszeniu o 74,40%, a w grupie B-6 o 80,08% w porównaniu z odpowiednią grupą kontrolną. W układzie mieloblastycznym, oznaczonym na podstawie preparatów uzyskanych z kości zawierającej implant grupy B-3, nastąpiło statystycznie istotne (p <0,05) zwiększenie zawartości granulocytów obojętnochłonnych o 34,87% w porównaniu z wynikami uzyskanymi z kości udowej w grupie K-3. W odniesieniu do wyników uzyskanych u szczurów z grupy K-6 w badanej grupie B-6 zawartość granulocytów obojętnochłonnych zwiększyła się statystycznie istotnie (p <0,05) o 38,61%. Układ limfoblastyczny, oznaczony na podstawie preparatów uzyskanych z kości udowej szczurów z grupy K-3 lub K-6, stanowił odpowiednio 8,77% i 9,48% komórek szpiku kostnego. Zawartość układu limfoblastycznego szpiku kostnego kości zawierającej implant u szczurów z grupy B-3 i B-6 była statystycznie istotnie większa odpowiednio o 210,15% i 80,38% w odniesieniu do grup kontrolnych (zwiększyła się zarówno liczba limfoblastów, jak i limfocytów). Zawartość układu siateczkowo-śródbłonkowego w szpiku kości pozornie operowanej u szczurów z grupy K-3 wynosiła 5,26%. Podobny wynik uzyskano w kości udowej w grupie K-6 oraz w kości zawierającej implant w grupie B-3. W grupie B-6 zawartość monocytów, plazmocytów i komórek tucznych w szpiku kości z implantem była statystycznie istotnie większa w porównaniu z wynikami uzyskanymi u szczurów z grupy kontrolnej K-6. Komórki obserwowane w rozmazie szpiku kostnego kości zawierającej implant (grupa B-3 i B-6) nie wykazywały różnic w wielkości, kształcie i zabarwieniu w porównaniu z komórkami widocznymi w preparatach uzyskanych od szczurów odpowiedniej grupy kontrolnej (K-3 lub K-6).
Oznaczenia makrometryczne kości
Wyniki oznaczeń makrometrycznych (masy, długości, średnicy trzonu i średnicy nasady) wyizolowanych kości udowych szczurów z grupy K-3, B-3, K-6 i B-6 przedstawiono w tab. III. U zwierząt z grupy B-3 badane parametry makrometryczne były podobne do wyników uzyskanych w grupie szczurów K-3. Zabieg implantacji w grupie B-6 spowodował w badanej kości statystycznie istotne zwiększenie masy (p <0,05) o 12,11%, statystycznie istotne zwiększenie średnicy trzonu w płaszczyźnie czołowej (p <0,05) o 7,42% oraz statystycznie istotne zwiększenie średnicy nasady dalszej mierzonej w płaszczyźnie czołowej (p <0,05) o 5,89% i w płaszczyźnie strzałkowej (p <0,005) o 11,42% w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie K-6. Parametry makrometryczne kości piszczelowej prawej w grupie zwierząt B-6 były takie jak u szczurów z grupy K-6.
Oznaczenia histomorfometryczne kości
U zwierząt z grupy B-3 całkowita powierzchnia przekroju poprzecznego trzonu kości z implantem oraz powierzchnia przekroju poprzecznego jamy szpikowej tej kości mierzone od strony nasady bliższej, w połowie kości oraz mierzone od strony nasady dalszej były podobne do wyników uzyskanych u szczurów z grupy K-3 (ryc. 1.). U zwierząt z grupy B-6 całkowita powierzchnia przekroju poprzecznego trzonu kości z implantem mierzona od strony nasady bliższej, w połowie kości oraz mierzona od strony nasady dalszej była większa odpowiednio o 5,07%, 5,99% (p <0,05) i 7,38% (p <0,005) w porównaniu z wynikami uzyskanymi u szczurów z grupy K-6. Powierzchnia przekroju poprzecznego jamy szpikowej kości zawierającej implant w grupie B-6 była mniejsza od strony nasady bliższej o 2,02%, mierzona w połowie kości o 17,83% (p <0,001) i mierzona od strony nasady dalszej o 13,98% (p <0,005) w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie K-6 (ryc. 1.). U szczurów z grupy B-3 przyrost zewnętrzny i przyrost wewnętrzny na grubość kości z implantem był taki, jak w grupie zwierząt kontrolnych K-3 (ryc. 2.). U szczurów z grupy B-6 zewnętrzny przyrost kości z implantem na grubość uległ statystycznie istotnemu zwiększeniu o 8,06% (od strony nasady bliższej; p <0,05), o 10,89% (w połowie długości kości; p <0,005) i o 6,85% (od strony nasady dalszej; p <0,05) w porównaniu z grupą K-6. Wewnętrzny przyrost tej kości na grubość był statystycznie istotnie większy w porównaniu ze zwierzętami z grupy K-6 o 15,18% od strony nasady bliższej (p <0,005), o 8,12% w połowie kości (p <0,05) i o 6,26% od strony nasady dalszej (p <0,05) (ryc. 2.). Szerokość warstwy osteoidu zewnętrznego w kości pozornie operowanej w grupie K-3 mierzona od strony nasady bliższej wynosiła 10,263±1,378 µm, mierzona w połowie długości kości 11,758 ± 1,235 µm i mierzona od strony nasady dalszej 9,973±2,288 µm, natomiast szerokość warstwy osteoidu wewnętrznego tej kości wynosiła odpowiednio: 8,708±0,869 µm, 8,025±1,025 µm i 8,568±1,548 µm. U szczurów z grupy B-3 szerokość warstwy osteoidu zewnętrznego i szerokość warstwy osteoidu wewnętrznego była podobna do odpowiednich wyników uzyskanych w grupie zwierząt kontrolnych K-3. W grupie K-6 szerokość warstwy osteoidu zewnętrznego mierzona od strony nasady bliższej wynosiła 10,212±2,003 µm, mierzona w połowie długości kości 11,501±1,535 µm i mierzona od strony nasady dalszej 9,901±1,294 µm, natomiast szerokość warstwy osteoidu wewnętrznego wynosiła odpowiednio: 8,687±1,669 µm, 8,000±1,875 µm i 8,475±1,628 µm. U szczurów z grupy B-6 szerokość warstwy osteoidu zewnętrznego i szerokość warstwy osteoidu wewnętrznego w kości z implantem były podobne do odpowiednich wyników uzyskanych w grupie zwierząt kontrolnych K-6. U szczurów z grupy K-3 i K-6 grubość beleczek kostnych nasady dalszej kości pozornie operowanej wynosiła odpowiednio: 77,170±3,430 µm i 88,921±2,866 µm. U zwierząt z grupy B-3 i B-6 grubość beleczek kostnych nasady dalszej kości z implantem była podobna do wyników uzyskanych w odpowiedniej grupie kontrolnej K-3 lub K-6. Szerokość chrząstki nasadowej nasady dalszej kości pozornie operowanej u zwierząt z grupy kontrolnej K-3 wynosiła 114,21±13,90 µm, a u szczurów z grupy kontrolnej K-6 79,44±10,80 µm. Podobny wynik uzyskano w grupach szczurów z implantem (B-3 lub B-6).
Dyskusja
W opisywanym nowym modelu osteomyelitis aseptica chronica implant jałowej nitki bawełnianej był wprowadzony do jamy szpikowej kości udowej prawej u szczurów z badanych grup na 3 lub 6 tyg. U zwierząt z grup kontrolnych zarówno w eksperymencie 3-, jak i 6-tygodniowym wykonano w kości udowej prawej zabieg pozorny (bez zakładania implantu) w celu oceny wpływu inwazji do kości, wynikającej z wykonanego samego zabiegu operacyjnego. Dlatego u szczurów kontrolnych porównywano oznaczenia hematologiczne szpiku kostnego i oznaczenia morfometryczne kości udowej prawej, pozornie operowanej z wynikami uzyskanymi z kości udowej lewej (nieoperowanej) u tych samych zwierząt. Wyniki pomiarów w tych dwóch kościach udowych zwierząt z grup kontrolnych nie wykazywały różnic pomiędzy sobą. Wyniki te pozwalają na wykluczenie wpływu wykonania samego zabiegu operacyjnego na badane parametry hematologiczne i morfometryczne kości udowych zawierających implant u szczurów z badanych grup. U zwierząt, u których wykonano zabieg operacyjny implantacji jałowej nitki do jamy szpikowej kości udowej na 3 lub 6 tyg., oraz w grupach szczurów kontrolnych pozornie operowanych nie obserwowano unieruchomienia kończyny ani żadnych odczynów miejscowych lub ogólnych, świadczących o szerzeniu się stanu zapalnego z kości na tkanki sąsiednie. Aby się upewnić, czy obecność implantu jałowej nitki w jamie szpikowej kości udowej wywołuje stan zapalny, przeprowadzono oznaczenia parametrów hematologicznych szpiku kostnego i krwi obwodowej. W tym celu wykonano oznaczenia zawartości komórek układu erytroblastycznego, układu mieloblastycznego, układu limfoblastycznego, układu płytkowego, układu siateczkowo-śródbłonkowego szpiku kostnego. Oznaczenia składu odsetkowego komórek szpiku kostnego kości udowej prawej, w której dokonano implantacji na 3 tyg., wykazały zmniejszenie liczby komórek układu erytroblastycznego, z jednoczesnym zwiększeniem liczby komórek układu mieloblastycznego (granulocytów obojętnochłonnych) i zwiększeniem liczby komórek układu limfoblastycznego (limfoblastów i limfocytów), bez wpływu na układ płytkowy i układ siateczkowo-śródbłonkowy. U zwierząt z implantem w kości przez 6 tyg. dodatkowo zwiększyła się liczba komórek układu siateczkowo-śródbłonkowego szpiku kostnego, tj. monocytów, plazmocytów i komórek tucznych. Te zmiany w składzie odsetkowym komórek szpiku kostnego świadczą o toczącym się stanie zapalnym w jamie szpikowej kości udowej prawej, wywołanym implantem jałowej nitki bawełnianej. Zwłaszcza zwiększenie się liczby komórek układu siateczkowo-śródbłonkowego w kości zawierającej implant przez 6 tyg. jak i sam czas eksperymentu mogą świadczyć o występowaniu przewlekłego stanu zapalnego. Granulocyty, limfocyty, monocyty, plazmocyty i komórki tuczne należą do komórek biorących udział w procesie zapalnym. Granulocyty wykazują działanie przede wszystkim w ostrej fazie procesu zapalnego, a limfocyty i monocyty występują w zapaleniu ostrym, ale w późniejszym jego okresie, oraz w zapaleniach przewlekłych. Plazmocyty i komórki tuczne są charakterystyczne głównie dla zapalenia przewlekłego. W badaniach scyntygraficznych zmienionej zapalnie kości królika również wykazano zwiększenie się liczby granulocytów (zwłaszcza w ostrym stanie zapalnym) oraz limfocytów (w stanie przewlekłym) [13]. Zmiany składu odsetkowego komórek szpiku kostnego kości udowej prawej z implantem znalazły odpowiedź w badaniach hematologicznych krwi obwodowej. Zmniejszeniu uległa liczba erytrocytów, odsetek hematokrytu oraz stężenie hemoglobiny, jako wynik zmniejszenia liczby komórek układu erytroblastycznego szpiku kostnego kości zawierającej implant przez 3 lub 6 tyg. Nie stwierdzono u tych zwierząt wzrostu liczby leukocytów we krwi obwodowej, co świadczy o braku szerzenia się procesu zapalnego poza jamę szpikową i kość. U szczurów z wszczepionym implantem obserwowano zmniejszenie masy ciała, zwłaszcza w eksperymencie 6-tygodniowym. U tych zwierząt nastąpiło również zwiększenie masy śledziony, co może być konsekwencją stanu zapalnego jamy szpikowej, ponieważ zasadniczą funkcją śledziony jest wytwarzanie, magazynowanie i rozkładanie elementów morfotycznych krwi, w czym współpracuje ona ze szpikiem kostnym. Przeprowadzone w niniejszej pracy badania morfometryczne kości obejmowały pomiary makrometryczne i histomorfometryczne kości. Zastosowanie implantu jałowej nitki bawełnianej do jamy szpikowej kości udowej na 6 tyg. wywoływało u szczurów (oprócz wcześniej opisanych zmian hematologicznych krwi obwodowej i szpiku kostnego) również zmiany w tkance kostnej. U zwierząt, które miały wszczepiony implant przez 3 tyg., nie stwierdzono zmian w badanych parametrach kości w porównaniu z odpowiednią grupą kontrolną. U szczurów, u których wywołano osteomyelitis aseptica chronica w wyniku implantacji na 6 tyg. jałowej nitki do jamy szpikowej kości udowej prawej, stwierdzono zwiększenie masy tej kości. Zastosowanie implantu powodowało również deformację tej kości przez zwiększenie średnicy trzonu w płaszczyźnie czołowej oraz zwiększenie średnicy nasady dalszej, zarówno w płaszczyźnie czołowej, jak i strzałkowej. W prowadzonych badaniach po wprowadzeniu implantu na 6 tyg. obserwowano zwiększenie całkowitej powierzchni przekroju poprzecznego trzonu tej kości – z jednoczesnym zmniejszeniem powierzchni przekroju poprzecznego jamy szpikowej. Zaobserwowane zmiany mogą świadczyć o nasileniu procesów kościotworzenia i osłabieniu resorpcji tkanki kostnej. Należałoby się wówczas również spodziewać wpływu stanu zapalnego wywołanego implantem na oznaczenia przyrostu kości na grubość. I tak stwierdzone w niniejszej pracy zwiększenie przyrostu zewnętrznego oraz przyrostu wewnętrznego na grubość po 6 tyg. eksperymentu świadczy o zaburzonych procesach przebudowy w kości udowej pod wpływem implantu. Ponieważ grubość osteoidu – zarówno zewnętrznego, jak i wewnętrznego – kości z implantem nie uległa zmianie, sugeruje to, że opisane powyżej zmniejszenie przyrostu tej kości na grubość może być wynikiem zahamowania osteoklastycznej resorpcji tkanki kostnej. Pomiędzy osteoklastami a komórkami układu monocytowo-makrofagowego istnieje bliskie pokrewieństwo i komórki te mają wspólne pochodzenie ze zrębu szpiku. W zależności od sprzyjających warunków i obecności stymulatorów CFU-GM (granulocyte, macrophage-colony forming unit) może się różnicować w szpiku w osteoklasty lub w komórki układu monocytowo-makrofagowego [14–17]. Dlatego obserwowane w prowadzonych badaniach zwiększenie liczby monocytów w szpiku kostnym kości zawierającej implant może być związane ze zmniejszeniem liczby osteoklastów, a więc z obserwowanym zahamowaniem procesów resorpcji. W celu zbadania czy przewlekły jałowy stan zapalny jamy szpikowej kości udowej z implantem oddziałuje, oprócz trzonu tej kości, na jej część nasadową i przynasadową, przeprowadzono oznaczenia grubości beleczek kostnych i szerokości chrząstki nasadowej nasady dalszej tej kości. Pomiary wykazały, że u szczurów z implantem grubość beleczek kostnych i szerokość chrząstki nasadowej była podobna do wyników uzyskanych w odpowiedniej grupie kontrolnej, pomimo opisanego wcześniej zwiększenia średnicy nasady tej kości (w eksperymencie 6-tygodniowym). Podobne zmiany w tkance kostnej zaobserwowano we wcześniejszych próbach z zastosowaniem implantu jałowej peletki bawełnianej przez 6 tyg. Zmiany te, choć słabsze, występowały również wtedy, gdy implant peletki znajdował się w kości przez 3 tyg. (w odróżnieniu od wyniku uzyskanego w niniejszej pracy) [9]. Uzyskane po 6 tyg. eksperymentu zmiany w tkance kostnej w wyniku wywołania osteomyelitis aseptica chronica odpowiadają tym, jakie są obserwowane u pacjentów, chociaż istnieją rozbieżne doniesienia naukowe dotyczące wpływu tej jednostki chorobowej na procesy przebudowy tkanki kostnej. Osteomyelitis u ludzi może przebiegać zarówno z nadmiernym kościotworzeniem, jak i z nasiloną resorpcją kości [18–20]. Na podstawie badań scyntygraficznych kości zmienionej zapalnie stwierdzono nasilenie się ogólnej przebudowy tkanki kostnej [21]. Osteomyelitis u ludzi może charakteryzować się deformacją kończyny zajętej procesem chorobowym [22, 23], a warstwa korowa kości długiej może być zbyt cienka lub pogrubiała [20, 23, 24]. Nasilenie się procesu przebudowy kości stwierdza się również u zwierząt z eksperymentalnym zapaleniem kości długiej i szpiku [25], co może doprowadzić do zakłócenia architektury tkanki kostnej zajętej procesem chorobowym [2]. We wcześniejszych badaniach z wykorzystaniem modelu osteomyelitis aseptica acuta u szczurów, u których implant jałowej nitki bawełnianej był pozostawiony na tydzień, kierunek zmian w tkance kostnej był odwrotny do obserwowanego w niniejszej pracy. W modelu osteomyelitis aseptica acuta nastąpiły: deformacja kształtu kości, zmniejszenie jej masy, zmniejszenie powierzchni przekroju poprzecznego trzonu kości i zwiększenie powierzchni jamy szpikowej oraz zmniejszenie przyrostu kości na grubość [10]. A zatem po tygodniu obecności implantu w jamie szpikowej wystąpiła osteomyelitis aseptica acuta z utratą tkanki kostnej. W opisywanej w niniejszej pracy osteomyelitis aseptica chronica zmiany w tkance kostnej po 6 tyg. eksperymentu miały natomiast charakter przerostowy. Dlatego można przypuszczać, że obserwowany brak zmian w badanych parametrach makrometrycznych i histometrycznych kości, w przypadku gdy implant był założony na 3 tyg., nie jest wynikiem braku oddziaływania stanu zapalnego na tkankę kostną, ale występujące wówczas zmiany mogą mieć charakter kompensacyjny, przeciwstawiający się destrukcji kostnej – tak więc kość osiągnęła takie parametry, jak u szczurów kontrolnych. Ponieważ w opisywanym modelu osteomyelitis aseptica chronica stan zapalny w kości utrzymywał się przez następne 3 tyg. (razem 6 tyg.), zmiany rozrostowe tkanki kostnej postępowały dalej. W opisywanym modelu osteomyelitis aseptica chronica u szczurów stan zapalny kości udowej prawej z implantem nie wpływał na pozostałe kości długie (kość udową lewą bez implantu oraz na kość piszczelową prawą przylegającą do kości udowej z implantem). Na podstawie opisywanych wyników można stwierdzić, że zastosowanie implantu jałowej nitki bawełnianej do kości udowej szczurów na 6 tyg. wywołuje osteomyelitis aseptica chronica, co pozwala na wykorzystanie go jako modelu eksperymentalnego, dzięki któremu będzie można poszerzyć możliwości badawcze nad patofizjologią i farmakoterapią tej jednostki chorobowej. Czas eksperymentu nie może być jednak krótszy niż 6 tyg., ponieważ można nie uzyskać zmian w tkance kostnej (3 tyg.) lub mogą one być charakterystyczne dla osteomyelitis aseptica acuta (tydzień). Opisana w pracy eksperymentalna metoda wywoływania osteomyelitis aseptica chronica oraz opublikowany wcześniej model osteomyelitis aseptica acuta u szczurów [10] stanowi alternatywę dla innych modeli eksperymentalnych stanu zapalnego kości i jamy szpikowej [2, 5–7].
Badania zostały wykonane w ramach projektu badawczego finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Informatyzacji nr 2P05D02129.

Piśmiennictwo 1. Gracia E, Lacleriga A, Monzon M, et al. Application of a rat osteomyelitis model to compare in vivo and in vitro the antibiotic efficacy against bacteria with high capacity to form biofilms. J Surg Res 1998; 79: 146-53. 2. Hienz SA, Sakamoto H, Flock JI, et al. Development and characterization of a new model of hematogenous osteomyelitis in the rat. J Infect Dis 1995; 171: 1230-6. 3. Littlewood-Evans AJ, Hattenberger MR, Luscher C, et al. Local expression of tumor necrosis factor alpha in an experimental model of acute osteomyelitis in rats. Infect Immun 1997; 65: 3438-43. 4. Littlewood-Evans AJ, Hattenberger MR, Zak O, et al. Effect of combination therapy of rifampicin and azithromycin on TNF levels during a rat model of chronic osteomyelitis. J Antimicrob Chemother 1997; 39: 493-8. 5. Nelson DR, Buxton TB, Luu QN, et al. Animal models of osteomyelitis. Knowledge, hypothesis, and speculations. Infect Dis Clin North Am 1990; 4: 377-84. 6. Yoshii T, Magara S, Miyai D, et al. Local levels of interleukin-1 beta, -4, -6 and tumor necrosis factor alpha in an experimental model of murine osteomyelitis due to staphylococcus aureus. Cytokine 2002; 19: 59-65. 7. Hentunen TA, Choi SJ, Boyce BF, et al. A murine model of inflammatory bone disease. Bone 2000; 26: 183-8. 8. Rump S, Kleinrok Z. Farmakometria – doświadczalne metody badania leków. PZWL, Warszawa 1982; 325. 9. Kaczmarczyk-Sedlak I, Janiec W. Wpływ jałowego stanu zapalnego jamy szpikowej na kości długie u szczurów. Post Osteoartrol 2003; 14: 77-85. 10. Kaczmarczyk-Sedlak I. Charakterystyka nowego eksperymentalnego modelu osteomyelitis aseptica acuta u szczurów. Post Osteoartrol 2005; 16: 17-25. 11. Tripp EJ, MacKay EH. Silver staining of bone prior to decalcification for quantitative determination osteoid in sections. Stain Technol 1972; 47: 129-33. 12. Milch RA, Rall DP, Tobie JE. Bone localization of tetracyclines. J Natl Cancer Inst 1957; 19: 87-93. 13. Kaps HP, Georgi P. Die Leukozytenszintigraphie mit 111-Indium bei akuter und chronischer Osteomyelitis im Tiermodell-Ein experimentelle Studie [Indium-111 scintigraphy in acute and chronic osteomyelitis in animal model]. Nuklearmedizin 1986; 25: 61-70. 14. Fuller K, Chambers TJ. Parathyroid hormone induces bone resorption in human peripheral blood mononuclear cells. Int J Exp Pathol 1998; 79: 223-33. 15. Quinn JM, Neale S, Fujikawa Y. Human osteoclast formation from blood monocytes, peritoneal macrophages and bone marrow cells. Calcif Tissue Int 1998; 62: 527-31. 16. Roodman GD. Advances in bone biology: the osteoclast. Endocr Rev 1996; 17: 308-32. 17. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev 1992; 13: 66-80. 18. Eswar N. Garre’s osteomyelitis: a case report. J Indian Soc Pedod Prev Dent 2001; 19: 157-9. 19. Suei Y, Taguchi A, Tanimoto K. Diagnostic points and possible origin of osteomyelitis in synovitis, acne, pustulosis, hyperostosis and osteitis (SAPHO) syndrome: a radiographic study of 77 mandibular osteomyelitis cases. Rheumatology 2003; 42: 1398-403. 20. Œwiątkowski J, Półtorak D, Błasińska-Przerwa K i wsp. Zmiany zapalne kości – temat zawsze aktualny. Ortop Traumatol Rehab 2002; 4: 716-21. 21. Schauwecker DS. The scintigraphic diagnosis of osteomyelitis Am J Roentgenol 1992; 158: 9-18. 22. Orzechowski W, Morasiewicz L, Kucharski R i wsp. Odległe wyniki wydłużenia i korekcji osi według metody Ilizarowa w pozapalnych skróceniach i zniekształceniach kości ramiennej. Ortop Traumatol Rehab 2002; 4: 316-23. 23. Segev E, Hayek S, Lokiec F, et al. Primary chronic sclerosing (Garre’s) osteomyelitis in children. J Pediatr Orthop B 2001; 10: 360-4. 24. Olszewska-Konarska M, Bielawski J. Krwiopochodne zapalenie kości w przebiegu łuszczycy. Chir Narz Ruchu 2002; 67: 69-72. 25. Philipov JP, Pascalev MD, Aminkov BY, et al. Changes in serum carboxyterminal telopeptide of type I collagen in an experimental model of canine osteomyelitis. Calcif Tissue Int 1995; 57: 152-4.