Genome editing in therapy: immunological context

Konsekwencje immunologiczne zastosowania technik edycji genomu na poziomie komórek pluri- i multipotentnych

W artykule podjęto próbę przedstawienia złożonych, immunologicznych konsekwencji zastosowania edycji genomu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (induced pluripotent stem cells – iPSc) oraz multipotencjalnych komórek macierzystych w celach terapeutycznych. Za technologię reprogramowania (otrzymywania iPSc) przyznano Nagrodę Nobla w 2012 roku. Największą przeszkodą jej upowszechnienia w terapii jest ryzyko rozwoju potworniaków (teratoma). Powoli jednak biotechnolodzy tworzą takie terapie komórkowe zależne od iPSc, aby uniknąć ryzyka rozwoju tych guzów [1]. W przypadku chorób krwi i szpiku edycja hematopoetycznych komórek macierzystych (hematopoetic stem cells – HSC) pozwala ominąć ten problem. Z kolei na korzyść iPSc przemawia to, że łatwiej je hodować w warunkach in vitro niż HSC, a zatem łatwiej modyfikować. Niemniej metody hodowli HSC są stale udoskonalane. Z immunologicznego punktu widzenia istotne jest to, że reprogramowanie lub też pobranie szpiku prowadzi do otrzymania komórek do przeszczepu autologicznego. Komórki iPSc otrzymuje się z dojrzałych komórek dawcy. Mogą to być komórki skóry czy nawet komórki z osadu moczu. Wydaje się, że połączenie reprogramowania czy pobrania szpiku z technologią edycji genomu gwarantuje uniknięcie problemów powodowanych przez mechanizmy związane z odrzuceniem przeszczepu. Sytuacja jest jednak bardziej skomplikowana. W związku z tym, że większość chorób genetycznych dziedziczy się w sposób recesywny, należy mieć na uwadze, iż połączenie tych metod stwarza pewien problem. W organizmie takiego chorego niekiedy nie stwierdza się przed transplantacją białka prawidłowego, a nawet nieprawidłowego. Sytuacja taka nie występuje, jeśli choroba wynika z mutacji dominującej. W tym przypadku powstaje prawidłowe białko kodowane przez jeden prawidłowy allel genu, którego heterozygotyczna mutacja w drugim allelu warunkuje chorobę i syntezę zmutowanego białka (zazwyczaj na skutek mutacji typu zmiany sensu, missense). Jak wskazano, takich chorób genetycznych jest mniej [2]. W przypadku schorzeń dziedziczonych w sposób recesywny możliwe są w uproszczeniu dwie sytuacje: w obrębie białka zmienia się pojedynczy aminokwas (nie przesuwa się ramka odczytu) albo zmiana jest większa, włącznie z brakiem białka wskutek mutacji typu nonsens. Szczególnie ten ostatni przypadek jest niekorzystny dla prób zastosowania edycji genomu na poziomie nietotipotencjalnych komórek macierzystych. W tej sytuacji po zastosowaniu np. multipotencjalnych komórek macierzystych ze zmienionym genomem u dorosłego chorego następuje produkcja białka, z którym układ odpornościowy osoby leczonej się nie zetknął wcześniej. Można więc powiedzieć, że komórki poza produkowanym białkiem są autogenne, ale białko terapeutyczne dla tego osobnika przypomina niekiedy białka odległe filogenetycznie, a obserwowane komplikacje mogą przypominać te, które opisywano w odniesieniu do klasycznej terapii genowej [3]. Sytuacja jest podobna do tych, gdy chory poddawany jest np. terapii z zastosowaniem preparatu białkowego, takich jak w około 10% przypadków hemofilii, kiedy występują mutacje typu nonsens. Oczywiście brak białka czynnika VIII lub IX w organizmie chorego przed podaniem go w terapii nie jest jedyną przyczyną braku tolerancji immunologicznej, ale ta zmienna jest istotna [4, 5]. Chorób warunkowanych występowaniem mutacji typu nonsens jest wiele, ale nieprzypadkowo wskazano hemofilię, ponieważ zjawisko występowania przeciwciał przeciwko podawanym terapeutycznym preparatom białkowym jest w tym przypadku dobrze opisane, podobnie jak skuteczność edycji genomu komórek z mutacją warunkującą hemofilię za pomocą techniki CRISPR [6, 7]. W przypadku zastosowania autogennych komórek macierzystych zaczynających produkować białko, którego wcześniej komórki osoby poddawanej terapii nie produkowały, problem ten będzie występował częściej [8]. Terapia z wykorzystaniem metod edycji genomu jest jak do tej pory wyjątkowo mocno personalizowana. Poza komórkami autogennymi w zależności od mutacji konieczne jest przygotowanie właściwego sgRNA lub uwzględnienie sekwencji PAM, odpowiedniej dla miejsca edycji. Konsekwencje zastosowania tego podejścia będą bardzo trudne do przewidzenia i odpowiedzi układu odpornościowego pacjentów na te przeszczepy różnorodne.
Bardzo często dyskutuje się, na ile techniki edycji genomu są lepsze od klasycznej terapii genowej. Należy zauważyć, że nadal rozważa się zastosowanie terapii genowych polegających na wprowadzeniu transgenów do komórek chorego. W przypadku chorób recesywnych, w których nie ma efektu nabycia nowej funkcji, klasyczna terapia genowa ma pewne szanse na sukces. Czym innym jest współistnienie transgenu terapeutycznego z genem chorobotwórczym, nawet w przypadku choroby dziedziczonej recesywnie, niż „naprawienie” obu alleli genu z mutacjami. Również w przypadku klasycznej terapii genowej więcej szans wydaje się mieć zastosowanie komórek modyfikowanych ex vivo, ponieważ próby modyfikowania za pomocą wirusów niosących transgen leczniczy komórek in vivo są o wiele bardziej niebezpieczne dla pacjenta (ryc. 1) [9]. Ponadto w terapii in vivo występuje również problem efektywnego dostarczania transgenu do odpowiednich komórek. W terapii genowej jest to transgen leczniczy, z kolei w przypadku technik edycji genomu – transgen kodujący CAS9 lub białko chimerowe PE. Zastosowane in vivo wirusy mogą prowadzić do wystąpienia chorób infekcyjnych czy mutowania genów (miejsce wprowadzenia transgenu jest przypadkowe), a efekty wprowadzenia transgenów do komórek dojrzałych są przejściowe. Wydajność takich zabiegów jest również znikoma. Gen edytowany podlega naturalnej regulacji ekspresji, ponieważ jest kontrolowany przez fizjologiczny promotor. Transgen wprowadzany w trakcie klasycznej terapii genowej ma promotor sztuczny, co również działa na korzyść edycji genomu. Techniki edycji genomu mają przewagę w stosunku do klasycznej terapii genowej również w przypadku chorób genetycznych warunkowanych mutacjami dominującymi. W tych chorobach białko prawidłowe współistnieje w komórkach chorego ze zmutowanym, więc gen zmutowany musi być edytowany do prawidłowego, aby poprawić stan pacjenta. Wprowadzenie kopii transgenu prawidłowego, obok istniejącej kopii genu prawidłowego, nie musi przynieść poprawy. Wiele białek funkcjonuje jako trimery, a nawet tetrametry, w których każda podjednostka musi być prawidłowa. Z kolei prowadzenie prac z komórkami iPSc lub multipotencjalnymi komórkami macierzystymi pozwala na selekcję odpowiednich klonów – takich, które mają genom edytowany w zamierzony sposób, oraz takich, które zawierają odpowiednią liczbę kopii transgenu. Dodatkowo wypada przyznać, że w przypadku terapii in vivo wykryto dość wyraźną immunogenność CAS-9, co tym bardziej uzasadnia działania ex vivo z koniecznością stosowania transgenu CAS-9 w wektorach episomalnych i jest to zmienna działająca na korzyść klasycznych terapii genowych [10].
Warto w tym miejscu przypomnieć, że obecnie nie wolno edytować genomów ludzkich komórek totipotencjalnych, czyli takich, z których można otrzymać cały organizm ludzki, zarodków, płodów oraz gamet. Można natomiast, jak opisano powyżej, dokonywać edycji genomu autogennych indukowanych komórek pluripotencjalnych, komórek multipotencjalnych i komórek dojrzałych. Uzasadnienie tego zakazu jest skomplikowane i wykraczające poza wady CRISPR-CAS9 czy PE, ale obawa przed powstaniem organizmów ze zmianami w genomie innymi niż zaprojektowane i przekazywanymi do kolejnych pokoleń jest ważną przesłanką. Więcej można się dowiedzieć o zasadach podejmowania takich decyzji chociażby z uzasadnienia wyroku TSUE [11]. Oczywiście edycja genomu na poziomie komórek totipotencjalnych nie powodowałaby problemów związanych z produkcją „obcego” białka przez komórki autogenne. Bez wątpienia zakaz jej prowadzenia na poziomie komórek totipotencjalnych w przypadku ludzi ma poważne podstawy, a terapia na tak wczesnym etapie życia nawet po ewentualnym zniesieniu zakazu nie będzie szybko możliwa. Przyjmując więc do wiadomości orzecznictwo TSUE lub decyzje innych instytucji odpowiedzialnych za regulację działań terapeutycznych z zastosowaniem edycji genomu oraz konieczność ich stosowania po urodzeniu, trzeba liczyć się z tym, że w niektórych przypadkach w trakcie takiej terapii dojdzie do odrzucenia przeszczepu komórkowego. Z merytorycznego punktu widzenia jedną z najważniejszych przesłanek zakazu jest nieprzewidywalność konsekwencji zastosowania technik edycji genomu na poziomie zarodka dla gatunku ludzkiego, wynikająca ze skomplikowanych procesów towarzyszących edycji genomu opisanych w piśmiennictwie [12–15]. Najogólniej ujmując, błędy edycji są eliminowane poprzez selekcję negatywną komórek niepożądanych. Nie ma przy tym zgody na selekcję w celach terapeutycznych spośród tysięcy komórek totipotencjalnych marginalnej populacji wykazującej pożądany genom, tak jak wolno to robić w przypadku komórek pluripotencjalnych czy multipotencjalnych. Ponadto wychwycenie wszystkich błędów wymagałoby sekwencjonowania całego transkryptomu komórek, z bardzo dużym pokryciem, aby wykryć nawet niewielki odsetek komórek z nieplanowanymi zmianami genomu. Wprowadzenie populacji komórek multipotencjalnych z błędnie edytowanym genomem do organizmu biorcy nie wywoła jednak tak negatywnych skutków jak rozwój całego organizmu z takimi błędami w genomie – organizmu, który może je przekazać potomstwu. Z tego powodu zakaz edycji genomu obejmuje również gamety. Niektórzy pacjenci z chorobami genetycznymi kwestionują ten zakaz, ponieważ nawet jeśli sami zostaną wyleczeni, ich potomstwo może być chore. Nawet gdyby takie restrykcje zniesiono, to bez wątpienia edytowanie genetyczne pochodnych hematopoetycznych komórek macierzystych stosować się będzie w terapii osób urodzonych z chorobą genetyczną lub też w przypadku edycji genomów CAR-T.

Technologia edycji genomu w chorobach z dysfunkcją komórek układu odpornościowego

W przypadku CRISPR-CAS9 jedną z pierwszych sytuacji, która przyciągnęła uwagę nie tylko biotechnologów, była próba zablokowania transmisji wirusa HIV w czasie życia płodowego przeprowadzona w Chinach [16]. Wiadomo, że gen kodujący receptory chemokinowe CCR5 i CXCR4 (koreceptory HIV) biorące udział w transmisji wirusa może być edytowany, co umożliwia jej zapobieganie. Procedura przeprowadzona w Chinach wymagała interwencji na etapie życia zarodkowego, co spotkało się nie tylko z dezaprobatą świata naukowego, ale nawet dość permisywnych biotechnologicznie lub bioetycznie władz Chin. Możliwość zastosowania technologii CRISPR-CAS9 w przypadku AIDS nie jest obecnie brana pod uwagę na wczesnych etapach życia zarodkowego lub płodowego, pomimo pewnych sukcesów w trakcie badań na zwierzętach [17]. Możliwe jest również w tym przypadku wykorzystanie pochodnych komórek iPSc czy HSC i zastosowanie w nich edycji np. genu CCR5, a następnie podanie komórek pacjentowi z AIDS [18]. W tym zakresie terapia genowa nie spełni swojej funkcji, ponieważ transgenowi kodującemu receptor chemokinowy wiążący się z białkami HIV będzie towarzyszył transgen kodujący odmianę receptora niewiążącego się z białkami HIV. Jeśli jednak użyje się połączenia technologii iPSc z CRISPR-CAS9 w celu edycji CCR5 i wyselekcjonuje się odpowiednie iPSc, to po wprowadzeniu do organizmu chorego otrzymanych z iPSc limfocytów T pojawi się znacząca populacja limfocytów opornych na HIV. Możliwe jest również oczyszczanie za pomocą edycji genomu limfocytów pacjenta ze zintegrowanego do jego genomu DNA wirusowego [19]. Podejście to stanowi przyczynek do rozważań nad usuwaniem z genomów DNA powstałego na skutek odwrotnej transkrypcji RNA różnych retrowirusów. Także wiele wirusów DNA próbowano eliminować za pomocą CRISPR-CAS9. Były to między innymi wirus opryszczki typu 1 (Herpes simplex virus 1 – HSV-1), wirus cytomegalii (CMV) czy wirus Epsteina-Barr (EBV) [20–22]. Ponieważ część wirusów wykorzystuje RNA jako zapis genetyczny, opracowuje się również systemy, które rozpoznają i eliminują ich RNA [23]. Tego typu podejście rozważano nawet w odniesieniu do SARS-CoV-2 [24]. W tym przypadku można nawet powiedzieć, że system CRISPR-CAS9 wrócił do swego pierwotnego działania, ale prowadzi je w komórkach eukariotycznych, a nie bakteryjnych. Bardzo dużą grupę chorych, u których można zastosować technologię CRISPR-CAS9 połączoną np. z iPSc, stanowią osoby z mutacjami dziedzicznymi, które powodują niedobory odporności. Technologia iPSc ma większe szanse sukcesu w przypadku chorób, w których komórki transplantowane są do krwiobiegu [25]. Przykładem takiej choroby, nieimmunologicznej, ale traktowanej jako klasyczny przykład zastosowania edycji w połączeniu z reprogramowaniem, może być anemia sierpowatokrwinkowa. W tym przypadku podanie HSC lub erytroblastów ze zmienionym genomem daje szansę na duży sukces terapeutyczny. Oznacza to następującą sekwencję działań: otrzymanie komórek iPSc, np. z komórek moczu pacjenta, ewentualnie bezpośrednio HSC ze szpiku; edycja genomu tych komórek w obrębie genu kodującego hemoglobinę; otrzymanie hematopoetycznych komórek macierzystych ze zmienionym („naprawionym”) genem hemoglobiny oraz podanie takich komórek pacjentowi i ich różnicowanie się do erytrocytów in vivo po zasiedleniu szpiku. W przypadku różnego typu dziedzicznych anemii trwają badania kliniczne. Choroby, takie jak mukowiscydoza, stanowią trudniejsze wyzwanie, ponieważ pojawienie się np. 20% komórek prawidłowych nie spowoduje tak wyraźnej poprawy jak w przypadku hemofilii.
Tradycyjna terapia genowa, podobnie jak edycja genomu, oferuje pewne rozwiązanie, gdy wprowadzenie transgenu umożliwia pojawienie się brakującego białka. Można tu wskazać ciężki złożony niedobór odporności, warunkowany mutacją genu deaminazy adenozynowej czy zespół Wiskotta-Aldricha [26–28]. Terapia genowa może być zastosowana także w przypadku komórek iPSc. Oczywiście podobnie w przypadku chorób immunologicznych, w których dochodzi do mutacji typu nonsens i które są warunkowane recesywnie, przeszczep komórek nie będzie stricte autologiczny. Niejednokrotnie jednak w chorobach immunologicznych obserwowane symptomy wynikają z nabycia nowych funkcji przez zmutowane białko i chorób genetycznych warunkowanych mutacją dominującą, a więc białko prawidłowe również jest obecne w komórkach chorego. Kiedy rozważa się tradycyjną terapię genową, nie można wyeliminować tego zjawiska. Umieszczonemu w komórce transgenowi o prawidłowej sekwencji towarzyszy gen zmutowany. Z kolei udana edycja genomu pozwala na zmianę zmutowanego genu, usuwając w ten sposób nabycie nowej funkcji. W takich przypadkach występuje wyraźna przewaga metod edycji genomu nad klasyczną terapią genową. Przykładem takiej choroby jest agammaglobulinemia dziedziczona w sposób sprzężony z chromosomem X oraz zespół aktywnego PI3K-δ [29, 30]. Choroby nowotworowe należą również do takich, w których dochodzi do dysfunkcji układu odpornościowego. Dlatego następnym, bardzo ważnym przykładem jest próba połączenia technologii edycji genomu z terapią z zastosowaniem limfocytów T z chimerowym receptorem antygenowym (chimeric antigen receptors T cells – CAR-T). CAR-T to nowy rodzaj terapii immunologicznej. Dzięki powstaniu białka chimerowego z połączenia domeny zmiennej przeciwciała rozpoznającego antygen nowotworowy z domenami transdukcji sygnału limfocytów cytotoksycznych powstaje funkcjonalna chimera limfocytu B i T, czyli limfocyt cytotoksyczny, który rozpoznaje bezpośrednio błonowy antygen nowotworowy za pomocą części immunoglobulinowej CAR. Nie ma potrzeby interakcji TCR z kompleksem antygen–MHC [31]. Jedną z przyczyn zaburzenia funkcjonowania układu odpornościowego w chorobach nowotworowych jest immunosupresja komórek układu odpornościowego na skutek interakcji receptora PD1 z ligandem PD-L1 [32]. Za pomocą technologii CRISPR-CAS9 czy PE można próbować usunąć geny kodujące białka uczestniczące w tej interakcji i w ten sposób utrudnić komórkom nowotworowym neutralizowanie ataku komórek CAR-T [33]. Powodów edycji genomu CAR-T jest jednak dużo więcej [34].
Ostatnim przykładem zastosowania edycji genomu w tym opracowaniu jest tworzenie komórek do uniwersalnych transplantacji (dla każdego pacjenta). Stosowana dotychczas w klinice technologia CAR-T wymaga wykorzystania komórek od pacjenta, który jest leczony. Znacznie utrudnia to procedurę, wydłuża czas do podania terapii CAR-T pacjentowi i zmniejsza szansę jej powodzenia, zwłaszcza gdy pacjent był poddawany wcześ­niej długotrwałej terapii, która uszkodziła jego komórki. W tej sytuacji próbuje się tworzyć tzw. uniwersalne CAR-T. W przypadku prób opracowania tzw. uniwersalnych CAR-T w grę wchodzi nawet połączenie technologii iPSc z CRISPR-CAS9 czy PE. W otrzymaniu uniwersalnych CAR-T należy zapobiec zarówno odrzuceniu przeszczepu obcych komórek, jakimi byłyby takie „obce” CAR-T, jak i atakowi uniwersalnych CAR-T przeciwko prawidłowym komórkom gospodarza. Należy więc za pomocą CRISPR-CAS9 czy PE usunąć (knock out) odpowiednie geny HLA oraz geny, takie jak TRAC. Wszystkie te manipulacje zdecydowanie łatwiej wykonywać na poziomie komórek, takich jak iPSc, które stosunkowo łatwo namnażać w warunkach in vitro (ryc. 2). Następnie z takich komórek można otrzymywać w wyniku różnicowania dowolną liczbę uniwersalnych CAR-T. Zapewne eliminacja odpowiednich genów HLA może pozwolić na otrzymanie komórek uniwersalnych do różnych celów, nie tylko do otrzymywania CAR-T. Jednak CAR-T stawia wyższe wymagania, ponieważ trzeba dokonać takiej edycji genomu, która zapewni ochronę zarówno przed odrzuceniem przeszczepu, jak i przed atakiem komórek przeszczepionych na komórki gospodarza. W przypadku wielu innych komórek, które można wykorzystać do uniwersalnego przeszczepu, a które nie wykazują ekspresji TCR, nie ma potrzeby ingerencji w geny, takie jak TRAC, a wystarczy dokonać usunięcia genu kodującego np. β2-mikroglobulinę, bez której MHC nie działa [35, 36]. Należy pamiętać, że usuwane w trakcie takiej edycji geny HLA nie powstały bez powodu, a takie komórki mogą stać się rezerwuarem patogenów albo zmienić się w komórki nowotworowe. Manipulacjom można poddawać także inne komórki układu odpornościowego niż limfocyty. W ostatnim czasie powstają nie tylko CAR-T, lecz także makrofagi z chimerowym receptorem antygenowym (chimeric antigen receptor macrophages – CAR-M) [37].

Podsumowanie

Układ odpornościowy zajmuje szczególne miejsce w zakresie stosowania technologii edycji genomu. Bierze się tu pod uwagę kilka zmiennych pozytywnych i negatywnych z punktu widzenia potencjału terapii z użyciem edycji genomu. Komórki, których genom poddano edycji, mogą być odrzucane przez układ odpornościowy, pomimo że iPSc lub HSC, z których je otrzymano, były autogenne. Nie ma obecnie możliwości edycji genomów płodów ludzkich, genomów komórek totipotencjalnych lub gamet w celach terapeutycznych. Terapie zależne od edycji genomu komórek pacjentów z chorobami genetycznymi prowadzącymi do niedoboru odporności mają większe szanse na sukces niż w przypadku chorób, takich jak dystrofia mięśniowa czy mukowiscydoza. Edycje genów, np. HLA, umożliwiają otrzymanie komórek uniwersalnych (dla dowolnego biorcy), znacznie skracając czas oczekiwania pacjenta na leczenie. Techniki edycji genomu są stosowane w terapii chorób infekcyjnych lub łączone w onkologii z terapiami CAR-T czy CAR-M, które są fundamentalnie immunologiczne.

Podziękowania

Publikacja finansowana ze środków Agencji Badań Medycznych w ramach projektu Polish Chimeric Antigen Receptor T-cell Network, numer 2020/ABM/04/00002. Podziękowania dla byRieske za pomoc w przygotowaniu rycin.

Konflikt interesów

Autor nie zgłasza konfliktu interesów.

Piśmiennictwo