Poszukiwanie serologicznego markera reumatoidalnego zapalenia stawów – rys historyczny

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest najczęściej występującą przewlekłą, układową chorobą tkanki łącznej, która dotyczy ok. 1% populacji na świecie.

Etiologia tej choroby pozostaje ciągle nieznana. Wiadomo natomiast, że na jej przebieg mają wpływ czynniki genetyczne, infekcyjne i hormonalne [1, 2].

Przebieg choroby jest zazwyczaj cykliczny, z przejściowymi remisjami. Niestety ok. 20% pacjentów cierpi na ciężką postać choroby, trudno poddającą się leczeniu, prowadzącą do kalectwa na skutek deformacji i zniszczenia stawów [3].

Kryteria rozpoznania RZS zostały sformułowane po raz pierwszy w 1958 r., a następnie zmodyfikowane w 1987 r. przez Amerykańskie Towarzystwo Reumatologiczne (American Rheumatism Association – ARA) [4, 5]. Obejmowały one 5 kryteriów klinicznych, 1 kryterium radiologiczne i 1 serologiczne – obecność czynnika reumatoidalnego klasy IgM.

Od 2010 r. obowiązują nowe kryteria RZS wprowadzone przez Amerykańskie Kolegium Reumatologiczne (American College of Rheumatology – ACR) i Europejską Ligę Przeciwreumatyczną (European League Against Rheumatism – EULAR) (kryteria ACR/EULAR), w których obok obecności czynnika reumatoidalnego pojawiła się także obecność przeciwciał anty-CCP [6].

U pacjentów z zaawansowaną chorobą postawienie diagnozy z reguły nie nastręcza trudności. Najczęściej obserwuje się u nich symetryczne zapalenie stawów, występują nadżerki kości potwierdzone radiologicznie i podwyższony poziom czynnika reumatoidalnego w surowicy. Problemy pojawiają się w przypadku wczesnego RZS.

Objawy towarzyszące RZS w pierwszych okresach choroby to: osłabienie, zmęczenie, bóle stawów i sztywność poranna, czasami gorączka. Podobne objawy mogą się pojawiać także w innych chorobach reumatycznych. Ponadto zajęcie stawów nie zawsze jest symetryczne, a u ok. 10–15% chorych pierwszymi zajętymi stawami mogą być stawy kolanowe, skokowe lub barkowe [7].

Radiologicznie potwierdzone nadżerki na powierzchni stawowej kości pojawiają się wg jednych autorów już w 4. miesiącu trwania choroby [3], wg innych – dopiero w 6. miesiącu [8], a po 2 latach występują u 2/3 wszystkich chorych [9]. Niestety, stwierdzane w badaniu radiologicznym nadżerki są nieodwracalne, dlatego tak istotne jest wczesne postawienie diagnozy i rozpoczęcie leczenia. Liczne badania wykazują, iż wcześniejsze wprowadzenie leków modyfikujących mogłoby złagodzić przebieg choroby [10, 11]. Dlatego nieustannie poszukuje się markerów serologicznych, których obecność w surowicy lub w płynie stawowym wyprzedzałaby wystąpienie objawów klinicznych RZS.

Uznanym kryterium serologicznym jest czynnik reumatoidalny IgM RF (rheumatoid factor).

Opisany 60 lat temu przez Waalera i Rosego czynnik reumatoidalny, nazwany później klasycznym, jest przeciwciałem klasy IgM reagującym z fragmentem Fc zmienionej ludzkiej lub zwierzęcej immunoglobuliny G [12, 13]. Do produkcji czynników reumatoidalnych dochodzi w wyniku immunizacji przez zagregowaną lub zmienioną IgG, związaną w kompleksie antygen–przeciwciało, poliklonalną stymulację komórek B lub niewyjaśnioną reakcję krzyżową między IgG i endogennym antygenem.

Klasyczny czynnik reumatoidalny IgM RF występuje w surowicy u 50–90% osób chorych na RZS (tzw. seropozytywne RZS) [14, 15], u ok. 30% dzieci chorych na młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów i u 2–30% osób zdrowej populacji [16, 17]. Z wiekiem odsetek osób o podwyższonym poziomie IgM RF wzrasta nawet do 40% [18].

Pierwotną metodą oznaczania czynnika reumatoidalnego był odczyn, który swoją nazwę uzyskał od połączonych nazwisk jego odkrywców. W Instytucie Reumatologii odczyn Waalera-Rosego wykonywany był niemal od początku istnienia Instytutu. W metodzie tej wykorzystuje się zdolność wiązania zawartego w badanych surowicach czynnika RF IgM z króliczą IgG, którą są opłaszczone czerwone krwinki barana. W przypadku reakcji pozytywnej dochodzi do hemaglutynacji krwinek. Jako wynik podawane jest najwyższe rozcieńczenie surowicy, w którym wystąpiła hemaglutynacja. Jest to metoda dość praco- i czasochłonna, wymagająca ustawiania długich szeregów probówek z roztworem krwi baraniej i rozcieńczonych surowic. Dużym uproszczeniem procedury oznaczania RF IgM były wprowadzone w latach 80. ubiegłego wieku testy lateksowe, w których zamiast krwinek baranich opłaszczonych króliczą IgG zastosowano cząsteczki lateksu opłaszczone ludzką IgG. Jako wynik dodatni traktuje się aglutynację lateksu w roztworze zawierającym 1 kroplę odczynnika lateksowego i 1 kroplę nierozcieńczonej surowicy badanej, nasilenie aglutynacji ocenia się na 1, 2 lub 3 plusy. Test lateksowy można traktować jako samodzielne badanie lub jako uzupełnienie bądź badanie poprzedzające test Waalera-Rosego.

W połowie lat 90. ubiegłego wieku w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii opracowano test ELISA do oznaczania czynników reumatoidalnych klasy IgG i IgA. Czynników reumatoidalnych innych klas niż IgM nie można oznaczyć metodami aglutynacyjnymi z powodu braku zdolności aglutynacyjnych.

Mikropłytkę opłaszczano króliczą IgG, z którą następnie mogły reagować obecne w surowicy czynniki reumatoidalne. Aby ustalić normy dla czynników reumatoidalnych oznaczanych tą metodą, przebadano dużą grupę osób zdrowych. Jako wynik dodatni przyjęto średnią wartość ekstynkcji w surowicach dawców plus 2 odchylenia standardowe [19].

Badanie na obecność tych czynników wykonuje się głównie w celach naukowych, szczególnie w celu monitorowania zmian zapalnych w obrębie naczyń krwionośnych i prognozowania ciężkości przebiegu choroby. Obecnie na rynku występują gotowe testy do oznaczania czynników reumatoidalnych różnych klas, jednak to nadal RF IgM jest rutynowo oznaczanym przeciwciałem w diagnostyce RZS.

Klasyczny czynnik reumatoidalny oznaczany jest dziś w Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej metodą immunochemiczną na analizatorze do białek specyficznych, w którym wykorzystuje się reaktywność czynnika z ludzką immunoglobuliną G.

Obecność wysokich mian czynnika reumatoidalnego nie ogranicza się jednak wyłącznie do surowic osób chorych na RZS. Występuje on w surowicach pacjentów z innymi chorobami tkanki łącznej, ale także w takich chorobach, jak: kiła, trąd, sarkoidoza, gruźlica, przewlekłe zakażenia paciorkowcami, trypanosomoza, malaria, infekcyjne zapalenie wsierdzia i wiele innych [20], co znacznie zmniejsza diagnostyczną wartość IgM RF. Trwają więc poszukiwania innych bardziej swoistych przeciwciał, pozwalających na wczesne rozpoznanie choroby.

Obecnie największym zainteresowaniem cieszą się przeciwciała dla cytrulinowanych białek ACPA (anti-citrullinated protein antibodies), których historia jest prawie tak długa, jak badania nad czynnikiem reumatoidalnym. Ponieważ długo nie udawało się odkryć antygenu docelowego tych przeciwciał, pojawiały się one pod różnymi nazwami.

W latach 60. XX w. Nienhuis i Mandema opublikowali pracę, w której opisali przeciwciała obecne w surowicach pacjentów chorych na RZS, reagujące ze składnikami granul keratochialiny otaczającymi jądro komórkowe. Przeciwciało to nazwali czynnikiem antyperynuklearnym (antiperinuclear factor – APF) [21]. Badacze dokonali tego odkrycia przy użyciu techniki immunofluorescencji pośredniej na ludzkich komórkach nabłonka policzkowej błony śluzowej. Dalsze badania wykazały, że przeciwciała APF występują w surowicach 49–91% chorych na RZS, ze swoistością 73–99% [22]. Niestety, ze względu na trudności techniczne przy pobieraniu materiału antygenowego, badanie to nigdy nie weszło na stałe do programu badań serologicznych. Wysoki odsetek komórek APF-dodatnich można uzyskać tylko u 5% dawców. Kolejne utrudnienie to standaryzacja tej metody oraz częściowo sama technika – immunofluorescencja pośrednia.

Dziesięć lat później dokonano kolejnego odkrycia przeciwciał specyficznych dla RZS – przeciwciał antykeratynowych (antikeratin antibodies – AKA) [23]. Wykryto je także metodą immunofluorescencji pośredniej, używając jako substratu skrawki przełyków szczurzych. Surowice, w których występowały przeciwciała AKA, wykazywały zdolność wiązania komórek warstwy rogowej nabłonka przełyku, a ponieważ główną składową tej warstwy jest keratyna, stąd nazwa tych przeciwciał. Czułość tego testu waha się od 40% do 60%, a swoistość wynosi 88–99% [23, 24].

Struktura antygenu, z którym reagują przeciwciała APF i AKA, długo pozostawała nieznana. Dopiero w 1992 r. Simon i wsp. metodą Western-blotting wyizolowali ze skóry ludzkiej białko o masie cząsteczkowej 40 kDa reagujące swoiście z surowicami osób chorych na RZS [25]. Białkiem tym okazała się neutralno-kwaśna izoforma filagryny.

Oczyszczone i wyizolowane metodą powinowactwa przy użyciu białka o masie cząsteczkowej 40 kDa, pochodzące od pacjentów z RZS frakcje IgG reagowały zarówno w testach APF, jak i AKA, co wskazywało, że są to przeciwciała o tej samej swoistości antygenowej [25]. Rozpatrywano nawet pomysł zmiany nazwy testu z AKA na AFA (anty-filaggrin antibodies) [26].

Filagryna (filament aggregating protein), znana także jako białko bogate w histydynę (histidine rich protein), z uwagi na dużą zawartość podstawień histydynowych (11–12%), jest białkiem epidermalnym, pełniącym funkcję „agregatora” filamentów cytokeratyny [27]. Białko to jest produkowane podczas późnej fazy różnicowania komórek nabłonkowych ssaków, jako silnie fosforylowane białko prekursorowe (profilagryna) składające się z kilku (10–12) powtarzających się jednostek filagryny rozdzielonych białkowym łącznikiem [28].

W procesie rogowacenia profilagryna ulega defosforylacji i staje się dostępna dla specyficznej proteazy, która odcina kationowe jednostki filagryny o masie cząsteczkowej 37 kDa [29]. Przeciwciała APF i AKA reagują z neutralno-kwaśną izoformą filagryny, stąd narodziło się przypuszczenie, że kluczową rolę w tych reakcjach odgrywa cytrulina [25]. W celu sprawdzenia tej hipotezy zsyntetyzowano kilka peptydów, w których w miejsce argininy podstawiono cytrulinę [28]. Badania te wykazały, że cytrulina jest główną składową determinantów antygenowych reagujących z przeciwciałami obecnymi w surowicach u chorych na RZS. Następnie wybrano peptyd zawierający cytrulinę, który wykazywał największą reaktywność z przeciwciałami, i użyto go jako antygenu opłaszczającego płytkę w teście ELISA. Okazało się, że najlepsze wyniki dawało użycie cyklicznego cytrulinowanego peptydu (CCP) [30]. Czułość tego pierwszego testu wynosiła 45%, swoistość zaś 96–100%. Pozytywną wartość prognostyczną oceniono na 91%, a negatywną na 78% [30, 31].

Niezależnie od opisanych wcześniej badań w 1994 r. Despres i wsp. odkryli przeciwciała anty-Sa, zawdzięczające swoją nazwę pierwszym literom nazwiska pacjenta, u którego je wykryto [32]. Bardzo długo antygen Sa pozostawał nieznanym białkiem o masie 48–50 kDa, które izolowano z ludzkiej śledziony, łożyska lub łuszczki reumatoidalnej. Dopiero w 2004 r. Vossennar i wsp. opublikowali artykuł dowodzący, że enigmatyczny antygen Sa to cytrulinowana wimentyna [33]. Badania wykazały, że przeciwciała anty-Sa nie reagują z rekombinowaną wimentyną, jednak in vivo wimentyna poddawana jest licznym posttranslacyjnym modyfikacjom, w tym także cytrulinacji. W ten sposób przeciwciała anty-Sa dołączyły do grupy przeciwciał dla cytrulinowanych białek.

Do grona antygenów cytrulinowanych na przestrzeni ostatnich lat zaliczono: fibrynogen, fibronektynę, antytrombinę III, kolagen typu II, -enolazę, znaną też jako antygen-CEP1 [34–37].

W latach 2000–2002 w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii IR podjęto próbę wyizolowania cytokeratyn ze skóry ludzkiej, będącej materiałem pooperacyjnym, oraz antygenu Sa z proszku acetonowego wątroby cielęcej i wołowej, które później mogłyby posłużyć jako antygen w teście ELISA. Udało się wyizolować białko o masie cząsteczkowej 40 kDa ze skóry ludzkiej. Częściowo oczyszczonym roztworem tego białka opłaszczono następnie mikropłytkę, na której przebadano 26 surowic osób chorych na RZS, 6 na niezróżnicowane zapalenie stawów (NZS), 5 na osteoartrozę, 2 na wirusowe zapalenie wątroby typu C (WZW C) oraz po 1 surowicy osób z chorobą Hashimoto, gammapatią, rakiem piersi i reaktywnym zapaleniem stawów. W celu ustalenia norm dla testu przebadano także 22 surowice osób zdrowych. Jednocześnie te same surowice przebadano immunofluorescencyjnym testem na obecność przeciwciał AKA. Pozytywny wynik uzyskano dla 50% surowic RZS w teście ELISA i 54% w teście immunofluorescencyjnym. Niestety obecność przeciwciał cytokeratynowych badanych testem ELISA wykryto także u pojedynczych pacjentów z NZS, rakiem piersi i WZW C. W teście AKA wynik dla tych surowic był ujemny, co świadczyło o konieczności dalszego oczyszczania antygenu użytego w teście ELISA. Pojawienie się na rynku gotowych testów oraz uciążliwa metoda ekstrakcji antygenów białkowych przy użyciu -merkaptoetanolu zniechęciły nas do dalszych badań w tym kierunku.

Początkowo badano obecność przeciwciał anty-CCP tylko w celach naukowych, od 2004 r. badanie to jest wykonywane także w celach diagnostycznych. Gotowe zestawy ELISA do oznaczania przeciwciał anty-CCP wykrywają przeciwciała klasy IgG, niekiedy w połączeniu z przeciwciałami IgA.

Aby sprawdzić różnice w częstości występowania przeciwciał anty-CCP w klasie IgG, IgA i IgM, przebadano w Instytucie Reumatologii 100 surowic pobranych od pacjentów z RZS, 50 surowic od osób z innymi chorobami tkanki łącznej i 50 surowic zdrowych dawców. Do badania użyto standardowej płytki opłaszczonej antygenem CCP. Najczęściej wykrywano przeciwciała w klasie IgG, 5–10% częściej niż w klasie IgA i IgM [dane niepublikowane]. Wydaje się więc, iż oznaczanie przeciwciał w klasie IgG jest w pełni satysfakcjonujące.

Obecnie przeciwciała anty-CCP oznaczane są w Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej metodą elektrochemiluminescencji. Zarówno w testach ELISA, jak i w testach immunochemicznych czy opartych na zasadzie chemiluminescencji podstawową reakcją jest wiązanie antygenu CCP ze swoistymi przeciwciałami.

Dziś wśród testów badających obecność przeciwciał dla cytrulinowanych białek, oprócz testów anty-CCP zawierających syntetyczne cykliczne cytrulinowane peptydy, pojawiają się także próby użycia jako antygenu konkretnych, rekombinowanych, cytrulinowanych białek. Dostępne są testy, w których jako antygen zastosowano cytrulinowaną rekombinowaną filagrynę, ludzką cytrulinowaną wimentynę, cytrulinowany syntetyczny peptyd pochodzący z IgG lub cytrulinowany syntetyczny peptyd z antygenu jądrowego EBV. Testy te różnią się między sobą zarówno czułością, jak i swoistością. Często wysoka czułość testu jest osiągana kosztem swoistości, należy się liczyć wtedy z możliwością uzyskania fałszywie dodatnich wyników. Według badań przeprowadzonych w 2007 r. przez dwa niezależne ośrodki [38, 39] użycie jako antygenu syntetycznych cytrulinowanych peptydów daje najbardziej swoiste i powtarzalne wyniki.

Z diagnostycznego punktu widzenia główną zaletą przeciwciał ACPA jest ich występowanie w bardzo wczesnej fazie choroby, niekiedy nawet kilka lat przed pierwszymi objawami [40], niestety nie ma jednoznacznych wyników badań co do wpływu tych przeciwciał na przebieg RZS, trudno jest też na podstawie ich poziomu monitorować postępy w leczeniu. Jako marker zmian pozastawowych oraz przeciwciało, którego poziom (do pewnego stopnia) odpowiada postępom w leczeniu, znacznie przydatniejszy wydaje się czynnik reumatoidalny. Jak dowiodły liczne badania, występowanie przeciwciał anty-CCP i RF IgM nie ogranicza się wyłącznie do reumatoidalnego zapalenia stawów, ponieważ pojawiają się one także w innych chorobach, choć z mniejszą częstotliwością. Wszystko wskazuje na to, że wprowadzenie do kryteriów choroby oceny poziomu przeciwciał anty-CCP obok obecności czynnika reumatoidalnego ułatwi diagnozowanie osób z podejrzeniem RZS, zwłaszcza w bardzo wczesnych stadiach choroby.

W badaniach naukowych większą uwagę poświęca się obecnie samemu procesowi cytrulinacji czy, jak ostatnio, karbamylacji [41], zmianom struktury i funkcji białek, zachodzącym w wyniku tych procesów, szczególnie w kontekście wpływu na patogenezę.

Piśmiennictwo

 1. Mackiewicz S, Hrycaj P. Reumatoidalne zapalenie stawów. W: Reumatologia, Mackiewicz S, Zimmerman-Górska I (red.). Wyd. Lek. PZWL, Warszawa 1995; 87-101.  

2. Firestein GS. Etiology and pathogenesis of rheumatoid arthritis. Kelley's Textbook of Rheumatology. Kelly WN, et al. (red.). WB Saunders, Philadelphia 1981; 921-966.  

3. Fleming A, Grown JM, Corbett M. Early rheumatoid disease. Ann Rheum Dis 1976; 35: 357-360.  

4. Arnett FC, Edwarthy SM, Bloch DA, et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988; 31: 315-324.  

5. Ropes MW, Bennet GA, Cobb S, et al. 1958 revision of diagnostic criteria of rheumatoid arthritis. Bull Rheum Dis 1958; 9: 175-176.  

6. Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al. 2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/Eurorean League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum 2010; 62: 2569-2581.  

7. Palster B. Rheumatoid disease and their management. Medical Tribune, Wisbaden 1999.  

8. Matsuda Y, Yamanaka H, Higamik K, et al. The lag between active joint inflammation and radiologic progression in patients with early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1998; 25: 427-432.  

9. Fuchs HA, Kaye JJ, Callahan LF, et al. Evidence of significant radiographic damage in rheumatoid arthrits within the first 2 years of disease. J Rheumatol 1989; 16: 585-591.

10. Wilke WS, Clough JD. Therapy for rheumatoid arthritis: combinations of disease-modifying drugs and new paradims of treatment. Semin Arthritis Rheum 1991; 21 (2 Suppl): 21-34.

11. Harris ED Jr. Rheumatoid artritis: pathophysiology and implications for Therapy. N Engl J Med 1990; 322: 1277-1289.

12. Waaler E: On the occurance of a factor in human serum activating the specific agglutination of sheep blood corpuscles. Acta Pathol Microbiol Scand 1940; 17: 172-188.

13. Rose HM, Ragan C, Pearce E, et al. Differential agglutination of normal and sensitized sheep erythrocytes by sera of patients with rheumatoid arthritis. Proc Soc Exp Biol Med 1948; 68: 1-6.

14. Gioud-Paquet M, Auvinet M, Raffin T. IgM rheumatoid factor (RF), IgA RF, IgE RF and IgG RF detected by ELISA in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1987; 46: 65-71.

15. Masi AT, Medsger TA. Epidemiology of the rheumatic diseases. Arthritis and Allied Conditions. McCarty DJ (ed.). Lea & Febiger, Philadelphia 1979.

16. Bennett PH, Wood PHN (eds). Population Studies of the Rheumatic Diseases. Excerpta Medica, Amsterdam 1968.

17. Carson DA. Rheumatoid factor. Kelley’s Textbook of Rheumatology. Kelly WN, et al. (ed.). WB Saunders, Philadelphia 1981; 677-690.

18. Williams RC Jr. Rheumatoid factor: historical perspective, origins and possible role in diseases. J Rheumatol 1992; Suppl 33: 42-45.

19. Biernacka E. Oznaczanie czynników reumatoidalnych klasy IgG i IgA metodą ELISA. W: Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. Luft S (red.). PWN, Warszawa 1996; 63-67.

20. Williams RC Jr. Rheumatoid factors and other serum components associated with rheumatoid arthritis. Rheumatoid Arthritis as a systemic Diseases. WB Saunders, Philadelphia 1974; 162.

21. Nienhuis RL, Mandema EA. A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis, the antiperinuclearfactor. Ann Rheum Dis 1964; 23: 302-305.

22. Hoet RM, Van Venrooij WJ. The antiperinuclear factor antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis. In: Rheumatoid Arthritis. Smolen J, Kalden J, Maini RN (eds). Springer – Verlag, Berlin 1992; 299-318.

23. Young B, Mallya R, Leslie R, et al. Antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br Med J 1979; 2: 97-99.

24. Hoet RM, Boerbooms AM, Arends M, et al. Antiperinuclear factor, a marker autoantibody for rheumatoid arthritis: colocalisation of the perinuclear factor and profilaggrin. Ann Rheum Dis 1991; 50: 611-618.

25. Simon M, Girbal E, Sebbag M, et al. The cytokeratin filament-aggregating protein filaggrin is the target of so-called “antikeratin antibodies” specific for rheumatoid arthritis. J Clin Invest 1993; 92: 1387-1393.

26. Aho K, Palosuo T, Lukka M. Antifilaggrin antibodies in recent – onset arthritis. Scand J Rheumatol 1999; 28: 113-116.

27. Harding CR, Scott IR. Histidine-rich proteins (filaggrins): structural and funcional heterogeneity during epidermal differentiation. J Mol Biol 1983; 170: 651-673.

28. Schellekens GA, de Jong BAW, van den Hoogen FHJ, et al. Citrulline is an Essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1998; 101: 273-281.

29. Girbal-Neuhauser E, Durieux JJ, Arnaud M, et al. The epitopes targeted by the rheumatoid arthritis-associated antifiaggrin autoantibodies are posttranslationally generated on various sites of (pro)filaggrin by deimitation of arginine residues. J Immunol 1999; 162: 585-594.

30. Sebbeg M, Simon M, Vincent C, et al. The antiperinuclear factor and the so-called anti-keratin antibodies are the same rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest 1995; 95: 2672-2679.

31. Kroot EJ, De Jong BA, Van Leeuwen MA, et al. The prognostic value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2000; 43: 1831-1835.

32. Despres N, Boire G, Lopez-Longo FJ, et al. The Sa system: a novel antigen-antibody system specific for rheumatoid arthritis. J Rhematol 1994; 21: 1027-1033.

33. Vossenaar ER, Despres N, Lapointe E, et al. Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target citrullinated vimentin. Arthritis Res Ther 2004; 6: 142-150.

34. Chang X, Yamada R, Suzuki A, et al. Citrillination of fibronectin in rheumatoid arthritis synovial tissue. Rheumatology 2005; 44: 1374-1382.

35. Chang X, Yamada R, Sawada T, et al. The inhibition of antithrombin by peptidylarginine deiminase 4 may contribute to pathogenecis of rheumatoid arthritis. Rheumatology 2005; 44: 293-298.

36. Takizawa T, Suzuki A, Sawada T, et al. Citrullinated fibrinogen detected as a soluble citrullinated autoantigen in rheumatoid arthritis synovial fluid. Ann Rheum Dis 2006; 65: 1013-1020.

37. Lundberg K, Kinloch A, Fisher BA. Antibodies to citrullinated -enolase peptide 1 are specific for rheumatoid arthritis and cross-react with bacterial enolase. Arthritis Rheum 2008; 58: 3009-3019.

38. Coenen D, Verschueren P, Westhovens R, et al. Technical and diagnostic performance of 6 assays for the measurement of ctrullinated protein/peptide antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis. Clinical Chemistry 2007; 53: 498-504.

39. Bizzaro N, Tonutti E, Tozzoli R, et al. Analytical and diagnostic characteristics of II 2nd- and 3rd- generation immunoenzymatic methods for the detection of antibodies to citrullinated proteins. Clinical Chemistry 2007; 53: 1527-1533.

40. Nielen MM, van Schaardenburg D, Reesink HW, et al. Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid arthritis. Arhritis Rheum 2004; 50: 380-386.

41. Mydel P, Wang Z, Brisslert M, et al. Carbamylation-dependent activation of T cells: a novel mechanism in the pathogenesis of autoimmune arthritis. J Immunol 2010; 184: 6882-6890.