Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń w ustaleniu swoistości autoprzeciwciał przeciwjądrowych w surowicach ANA-dodatnich na podstawie analizy poszczególnych swoistości przeciwciał obecnych w krążących kompleksach immunologicznych

Autoimmunizacja to stan permanentnej obecności w surowicach pacjentów autoprzeciwciał i autoreaktywnych limfocytów T, które są zaangażowane w patomechanizmy chorób tkanki łącznej. Autoprzeciwciała te zostały uznane za markery określonych jednostek chorobowych. Są one określane zbiorczo jako przeciwciała przeciwjądrowe (PPJ; anti-nuclear antibodies – ANA) i występują w różnych odsetkach u chorych na układowe choroby tkanki łącznej. Jednak w ok. 10–25% przypadków surowic pobranych od pacjentów ze schorzeniami reumatycznymi, w których wynik ANA jest dodatni, nie udaje się oznaczyć swoistości autoprzeciwciał. Jedną z możliwych przyczyn seronegatywności tych surowic może być kompleksemia – zwykle skojarzona z fazami zaostrzenia procesu podstawowego. Celem pracy była analiza krążących kompleksów immunologicznych (KKI) pod kątem ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych w osadach po PEG-6000 (glikolu polietylenowym) trudnych diagnostycznie surowic ANA-dodatnich. Zbadano 588 surowic pochodzących z klinik i polikliniki Instytutu Reumatologii, w których oznaczono: miano i typ świecenia ANA metodą immunofluorescencji (IIF) oraz obecność wybranych autoprzeciwciał metodą ELISA i Western-blotting . W przypadku 69 surowic (co stanowiło 11,7%) przy dodatnim wyniku ANA (rzędu ≥ 1/160) oznaczanie poszczególnych swoistości autoprzeciwciał dało wynik negatywny. Wobec tego zaproponowano nowe metodyczne podejście do analizy surowic ANA-pozytywnych, w których nie udaje się standardowymi metodami ustalić swoistości autoprzeciwciał. Zaproponowana metoda polega na analizie swoistości autoprzeciwciał nie w surowicy pełnej, ale w osadach po PEG-6000 z tych surowic . W ok. 84% tych osadów po dodaniu PEG uzyskano wyniki pozytywne testów Western-blotting, przy czym w znacznym odsetku (tj. 87%) wykazano więcej niż jedną swoistość (ryc. 1). Wśród 133 swoistości przeciwciał oznaczonych w 69 surowicach (średnio ok. 2 na surowicę) przeciwciała dla antygenów chromatynowych (anty-Hp i anty-dsDNA) stanowiły blisko 50% (73 oznaczonych swoistości) wszystkich oznaczanych swoistości. Przeciwciała dla antygenów ENA stanowiły 32% (43 oznaczonych swoistości), a pozostałe przeciwciała wystąpiły w 10,5% badanych surowic (ryc. 2). W większości badanych osadów po precypitacji PEG-6000 (72%) uzyskano pozytywną reakcję, tj. osłabienie linii po dodaniu do osadów PEG surowic anty-F(ab)2-IgG oraz tylko w ok. 30% osłabienie reakcji po dodaniu surowic anty-Fc-IgG. Efekt był niezależny od swoistości wykrywanego autoprzeciwciała, co może wskazywać na powierzchniową lokalizację tych autoprzeciwciał (ryc. 3, tab. I). Można mieć nadzieję, że opracowane podejście, po uproszczeniach niezbędnych dla celów rutynowej diagnostyki przeciwciał, znajdzie zastosowanie w serodiagnostyce autoprzeciwciał markerowych, i to nie tylko w diagnostyce układowych chorób tkanki łącznej.

Autoimmunity is a state of permanent persistence of the autoantibodies and autoreactive T lymphocytes in patients’ plasma engaged in pathomechanism of the connective tissue diseases (CTDs). Specific autoantibodies are recognized as “markers” for particular types of diseases. Such antibodies are known as anti-nuclear antibodies (ANA) and are present in different percentages in CTD patients. However, in about 10-25% of tested sera from rheumatic patients, where the ANA test is positive, estimation of particular ANA specificities is unsuccessful. One of possible reasons for such seronegativity is complexemia, usually correlated with the acute phase of the disease. The goal of researches was the analysis of the CIC (PEG-6000 sediments) for the presence of “marker” autoantibodies in a group of these “trouble-making” sera. Researches cover a group of 588 sera originating from Clinics and Outpatient Clinic of Institute of Rheumatology. In the sera a titre and type of ANA pattern (IIF-method) and presence of selected auto-antibodies (done by ELISA and Western-blotting method) were estimated. In 69 (11.7%) ANA-positive (titre ≥ 1/160) sera, the autoantibody estimation gave a negative result. Then, we proposed a new methodological approach to the analysis of ANA-positive sera where classical methods of ANA specificity assessment was unsuccessful. The new approach is based on the analysis of the ANA specificity not in sera but in PEG-6000 sediments (or possibly in γ-fractions from PEG sediments), which are generally composed of different serum macroglobulins and also contain a concentrated circulating immune complexe (CIC) fraction. Using this new method it was possible to estimate autoantibody specificity in 84% of the sera formerly negative, where the standard methodology was useless. It is worth noting that in about 87% of PEG sediments more than one ANA specificity appears (Fig. 1). Among 133 antibody specificities found in 69 sera (on average, 2 different antibodies per serum), antibodies to chromatin antigens (anti-dsDNA, Hp) were positive in about 50% of all estimated autoantibodies, whereas antibodies to ENA-antigens were positive in 32% and in the case of residual autoantibodies, positivity was discovered only in 10.5% of all cases (Fig. 2). Additionally, in most (72%) PEG-6000 sediments tested for autoantibodies, the positive reaction (weakness of the lines on Western blots in relation to controls) after treatment (incubated with PEG sediment blots) with anti-human F(ab)2-IgG antiserum and in 30% after incubation with anti-h-Fc-IgG antiserum was observed. The effect of weakening of lines on the Western blots after incubation with anti-F(ab)2 and anti-Fc sera was similar, independently of ANA antibody specificity, what shows that autoantibodies are located on the surface of the immune complexes (Fig. 3, Table I). One can hope that a new methodological approach developed after necessary adjustment (simplification) needed for routine antibody diagnostics, will be useful in diagnosis of marker autoanti­bodies not only in connective tissue diseases.