Przeciwciała przeciwko białku C-reaktywnemu u chorych na toczeń rumieniowaty układowy

Wstęp
Toczeń rumieniowaty układowy (TRU) jest przewlekłą, wielonarządową chorobą zapalną o podłożu autoimmunologicznym. Etiologia tocznia układowego jest złożona i nie w pełni wyjaśniona. Główną rolę w autoimmunizacji przypisuje się zaburzeniom usuwania produktów apoptozy, prowadzącym do przedłużonej ekspozycji antygenów na działanie układu odpornościowego [1]. Wśród czynników wpływających na zaburzenia usuwania produktów apoptozy w TRU wymienia się: małe stężenie białka C-reaktywnego (CRP), niedobór składników dopełniacza, zmniejszone stężenie białka MBL (białko wiążące mannozę) oraz wpływ niektórych autoprzeciwciał, takich jak przeciwko białkom ostrej fazy (w tym przeciwciała anty-CRP) i składowym dopełniacza [2]. Białko C-reaktywne, wiążąc się z komórką ulegającą apoptozie, rozpoczyna indukcję aktywacji dopełniacza drogą klasyczną, z opsonizowanych komórek uwalnia się wiele cząsteczek chemotaktycznych. Działa ono również jako opsonina, reagując z receptorem Fc na komórkach fagocytujących, co wzmacnia fagocytozę komórek ulegających apoptozie. Fakt, że u chorych na TRU stężenie CPR jest małe, może przyczyniać się do dłuższego usuwania produktów apoptozy, a tym samym do autoimmunizacji. Biało C-reaktywne ma zdolność wiązania się z błonami i wieloma składnikami jądra komórkowego komórek nekrotycznych, takich jak histony, małe jądrowe nukleoproteidy [3–6]. Celowe zatem wydaje się dokonane w niniejszej pracy oznaczenie występowania autoprzeciwciał anty-CRP, które mogą odpowiadać za małe stężenia CRP u chorych na TRU w mechanizmie wiązania w kompleksy immunologiczne. Mało zbadana jest także asocjacja pomiędzy obecnością u chorych przeciwciał anty-CRP a aktywnością choroby.
Materiał i metody

Grupa badana

Badania przeprowadzono w grupie 45 chorych na TRU (42 kobiety i 3 mężczyzn) w wieku 18–72 lat (średnia 39,1 ±13,4 roku). Pacjenci spełniali kryteria klasyfikacyjne tocznia rumieniowatego układowego opracowane przez Amerykańskie Towarzystwo Reumatologiczne [7]. Grupę kontrolną stanowiło 30 zdrowych dawców krwi w wieku 25–62 lat (średnia wieku 43,7 ±10,1 roku). Do oceny aktywności choroby zastosowano indeks SLEDAI. Częstość występowania poszczególnych objawów u pacjentów przedstawiono w tabeli I. Należałoby zwrócić uwagę na liczebność grupy pacjentów z zajęciem nerek w przebiegu tocznia układowego, jako powiązane z problematyką pracy. Aktywność choroby przedstawiono w tabeli II.
Profil autoprzeciwciał
W pierwszej kolejności, metodą immunofluorescencji pośredniej, przy użyciu linii komórkowej HEp-2010 (EUROIMMUN, Niemcy) oznaczano obecność oraz miano autoprzeciwciał przeciwjądrowych. Były one obecne u 35 pacjentów (77,78%). Najwyższe miano, otrzymane dla 6 chorych, wynosiło 1280. Metodą immunoblottingu – EUROLINE (EUROIMMUN, Niemcy), wykazano obecność autoprzeciwciał o swoistościach do różnych rozpuszczalnych antygenów jądrowych. Rozłożenie występowania przedstawiono w tabeli III.
Oznaczanie surowiczego stężenia hsCRP Oznaczenia dokonano metodą ELISA przy użyciu komercyjnego testu firmy BioCheck
Oznaczenie autoprzeciwciał anty-CRP Oznaczenie autoprzeciwciał anty-CRP klasy IgG wykonano w surowicy pacjentów oraz w zdrowej grupie kontrolnej przy użyciu metody ELISA. Oznaczenie wykonano na podstawie metodyki opublikowanej przez Roseau i wsp. [8] z własnymi modyfikacjami podanymi poniżej:
• W celu opłaszczenia płytki do studzienek reakcyjnych dodano po 100 µl buforu białko CRP + TRIS bufor (C-reactive protein, Human Serum, High Purity; Calbiochem Cat. No. 236603), stężenie białka: 6,07 mg/ml. Całość inkubowano przez 12 godz. w temperaturze 4°C. Po inkubacji czterokrotnie przepłukano studzienki poprzez dodanie 300 µl buforu płuczącego (0,05% Tween/TRIS bufor, pH 8,0 – Tris Bufered Saline with Tween 20; Sigma).
• Zablokowanie miejsc wiążących. Do każdego dołka naniesiono po 200 µl 1-procentowego roztworu BSA (bovine serum albumin, BSA; Sigma) w 0,05-procentowym Tween/TRIS (bufor blokujący) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 60 min, a następnie przepłukano 5-krotnie buforem płuczącym.
• Dodanie surowic. Nałożono po 50 µl rozcieńczonych surowic w 1-procentowym BSA w 0,05-procentowym Tween/TRIS buforze w stosunku 1 : 50. Ślepą próbę (blank) stanowił 1-procentowy roztwór BSA w 0,05-procentowym Tween/TRIS. Całość inkubowano w lodówce w temperaturze 4°C przez 12 godz., a następnie przepłukano buforem płuczącym.
• Dodanie koniugatu. Naniesiono po 50 µl rozcieńczonego w stosunku 1 : 1000 koniugatu w 1-procentowym roztworze BSA w 0,05-procentowym Tween/ /TRIS buforze (koniugat – przeciwciało skoniugowane z enzymem znacznikowym – alkaliczną fosfatazą, przeciwciało przeciw ludzkim łańcuchom γ dla przeciwciał klasy IgG; Anti-Human IgG – g-chain Specific – Alkaline Phosphatase; Sigma A3150) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 60 min. Następnie przepłukano buforem płuczącym.
• Dodanie substratu. Do każdej studzienki reakcyjnej dodano po 50 µl substratu: (p-nitrophenyl phosphate; Sigma N2765) i inkubowano na wytrząsarce (200 obrotów/min) w temperaturze pokojowej przez 1 godz. 20 min. Odczytu dokonano spektrofotometrycznie przy długości fali 405 nm.
Stężenie przeciwciał w poszczególnych surowicach określono co najmniej 3 razy. Wyniki oznaczeń wyrażono jako różnicę średniej ekstynkcji odczytanej dla danej próby do średniej ekstynkcji jednej z surowic badanych, oznaczonej na każdej płytce (współczynnik ekstynkcji – O.D. ratio). Za pozytywny wynik – obecność w badanej surowicy przeciwciał anty-CRP – traktowano wartość wyniku przekraczającą 3 odchylenia standardowe od wartości średniej wyniku w grupie kontrolnej, z uwzględnieniem 98-procentowego przedziału ufności.
Powtarzalność oznaczeń dla poszczególnych płytek i pomiędzy płytkami oceniono na podstawie analizy wariancji oraz współczynnika wariancji (CV%). Współczynnik wariancji dla oznaczeń w obrębie płytki nie przekraczał 10%, a pomiędzy płytkami 15%.
Wyniki opracowano, wykorzystując test U Manna-Whitneya, korelacje porządku rang Spearmana oraz jednostronny dokładny test Fischera. Za graniczny poziom istotności statystycznej przyjęto p < 0,05.

Wyniki
Wyniki oznaczania autoprzeciwciał anty-CRP metodą ELISA Średnia wartość ekstynkcji wszystkich surowic w grupie badanej wynosiła 0,515, a w grupie kontrolnej 0,479. Minimalna oraz maksymalna wartość ekstynkcji odpowiednio dla prób badanych i kontrolnych wynosiła: 0,227 i 0,255 oraz 1,930 i 0,787. Dla liczby odchylenia standardowego analogicznie: 0,32 i 0,13. Wyniki przedstawiono za pomocą szeregu rozdzielczego prostego i skumulowanego (tabela IV), a zobrazowano na rycinie 1 oraz 2.
Wyniki oznaczania hsCRP
Średnie stężenie hsCRP (high-sensitivity CRP) w grupie badanej wynosiło 5,28 mg/l. U 30 osób (66,67%) stwierdzono stężenia wynoszące poniżej 6 mg/l, z czego u 2 równe 0 mg/l. U 4 pacjentów stężenie wynosiło powyżej 15 mg/l, przy wartości maksymalnej wynoszącej 18 mg/l. Rozłożenie ilościowe pacjentów oraz grupy kontrolnej ze względu na stężenie hsCRP przedstawiono w tabeli V. Dla grupy kontrolnej średnie stężenie wyniosło 2,01 mg/l. Średnie stężenie hsCRP u chorych na TRU było istotnie większe (p < 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 3).
Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy między liczbą przeciwciał anty-CRP w grupie badanej i kontrolnej. Obecność przeciwciał anty-CRP (wartość ekstynkcji przekraczającą średnią ekstynkcję dla grupy kontrolnej +3 odchylenia standardowe) wykryto u 3 chorych na TRU), natomiast nie wykorzystano ich u żadnej osoby z grupy kontrolnej. W naszych badaniach stwierdzono brak korelacji pomiędzy obecnością autoprzeciwciał anty-CRP a stężeniem surowiczego hsCRP. Nie zaobserwowano również istotnych statystycznie różnic między aktywnością choroby mierzoną za pomocą skali SLEDAI a stężeniem hsCRP. Jednocześnie zaobserwowano, ale bez cech istotnych statystycznie, że pacjenci z większym stężeniem autoprzeciwciał przeciwko białku C-reaktywnemu wykazywali większą aktywność choroby niż pacjenci z małymi stężeniami przeciwciał.
Stwierdzono brak zależności między obecnością przeciwciał anty-CRP a zajęciem nerek w przebiegu TRU. Analiza korelacji wykazała brak związku między przeciwciałami anty-CRP a przeciwciałami antynukleosomowymi.
Wykazano ujemną korelację między wartością surowiczego stężenia hsCRP a stężeniem przeciwciał antynukleosomowych. Wysokie miana przeciwciał antynukleosomowych są związane z niskimi stężeniami surowiczego hsCRP (ryc. 4).
Omówienie
Pochodzenie przeciwciał anty-CRP jest nieznane. Jako pierwsi opisali je już w 1985 r. Robey i wsp. u jednego z ośmiu pacjentów z TRU [9]. W 1995 r. Bell i wsp. wykazali znaczną częstość występowania przeciwciał, w większości w klasie IgG, przeciwko CRP u pacjentów cierpiących na TOS (Toxic Oil Syndrome) [10], a następnie opublikowali dane dotyczące powszechnego występowania autoprzeciwciał przeciwko CRP w toczniu rumieniowatym układowym (78%). W naszych badaniach wykazano obecność przeciwciał anty-CRP u trzech pacjentów (6,67%) z 45-osobowej grupy. Wynik ten jest zbliżony jedynie do tego, jaki uzyskali Schoenfeld i wsp. [11]. Z przeglądu dostępnej literatury wynika, że wartość ta jest znacznie mniejsza niż uzyskana przez innych badaczy, którzy podają większy odsetek chorych na TRU z obecnymi przeciwciałami anty-CRP. Rosenau i wsp. [8], oznaczając przeciwciała tą samą metodą, uzyskali wynik 23%, co i tak już było wartością mniejszą niż podano w innych publikacjach na ten temat, gdzie wyniki wynosiły 32–78%. Za rozbieżność wyników w przedstawionej pracy może być odpowiedzialna różnica w populacji badanej. Wyjaśnienia różnic można również doszukać się w metodyce oznaczenia.
W 2006 r. Rosenau i wsp. [8] wykazali obecność przeciwciał anty-CRP w surowicach pacjentów z różnymi chorobami reumatycznymi, łącznie z TRU, w których zaobserwowano częstość występowania wynoszącą 23% (86 wyników pozytywnych z 413, w tym 43 ze 190 dla TRU). Autorzy sugerują, że rzadsze występowanie przeciwciał anty-CRP w ich badaniu w porównaniu z dotychczasowymi obserwacjami może być spowodowane odmienną metodą oznaczenia i różnicą w populacji badanej. Jednocześnie podają argumenty przedstawiające wiarygodność opracowanej metody, w których większe niż w przypadku oznaczeń pozostałych badaczy stężenie antygenu w studzience zapewniło jego dostateczną ilość. Ponadto dokonano etapu blokowania, co wyeliminowało reakcje niespecyficzne [8]. Do określenia przeciwciał w niniejszej pracy wykorzystano omawianą metodykę.
W pracy autorów niniejszego opracowania badano zależności między obecnością autoprzeciwciał anty-CRP a surowiczym stężeniem hsCRP. Związek ten może mieć znaczenie w patogenezie TRU, poprzez wiązanie przeciwciał anty-CRP z CRP, co może wpływać na szybkość usuwania produktów apoptozy. Podobnie jak Sjöwal i wsp. [12] oraz Rosenau i wsp. [8] autorzy opracowania wykazali brak korelacji między obecnością autoprzeciwciał przeciwko CRP a surowiczym stężeniem białka C-reaktywnego, oznaczonego metodą wysokiej czułości. Wynikałoby z tego zatem, że przeciwciała anty-CRP przypuszczalnie nie odpowiadają za małe stężenia surowiczego białka C-reaktywnego u chorych na TRU. Wydaje się, że nieadekwatnie małe przy istniejącym stanie zapalnym w przebiegu tocznia stężenia białka C-reaktywnego u osób z tą chorobą mogą być rezultatem polimorfizmu pojedynczego nukleotydu w genach promotorowych CRP [13, 14].
Wiadomo, że obecność określonych autoprzeciwciał może być związana z częstszym występowaniem pewnych objawów klinicznych choroby. Dlatego w pracy badano zależność między obecnością autoprzeciwciał anty-CRP a aktywnością i obrazem klinicznym choroby. Nie stwierdzono istotnie statystycznej różnicy między aktywnością choroby u chorych z obecnymi przeciwciałami przeciw białku C-reaktywnemu. Jednocześnie przy braku wyników statystycznie istotnych zaobserwowano, że chorzy z większym stężeniem przeciwciał anty-CRP wykazywali większą aktywność choroby niż chorzy, u których nie wykryto przeciwciał. Podobne wyniki spotykane są w publikacjach innych autorów [15–17].
Minatani i wsp. [16] dostrzegli zjawisko znacznie mniejszych surowiczych stężeń przeciwciał anty-CRP u chorych z białkomoczem, z wałeczkami komórkowymi w osadzie moczu i hipoalbuminemią. Wyniki badań mogą służyć do potwierdzenia opracowanego schematu patogenezy wtórnego kłębuszkowego zapalenia nerek u chorych na TRU. W modelu tym CRP byłoby hipotetycznie wystawione na powierzchni komórek, np. na komórkach śródbłonka, albo zaadsorbowane na błonie podstawnej kłębuszka nerkowego [18–20], gdzie krążące w krwiobiegu przeciwciała anty-CRP mogłyby się z nimi łączyć. Spowodowałoby to aktywację dopełniacza, co prowadziłoby do wzmocnienia i rozszerzenia stanu zapalnego [2].
W niniejszej pracy nie stwierdzono jednak korelacji między obecnością przeciwciał anty-CRP a zajęciem nerek.
Niemały wkład w dotychczasowym poznaniu relacji pomiędzy przeciwciałami anty-CRP a toczniem rumieniowatym układowym mają Sjöwal i wsp. W publikacji dotyczącej omawianego zagadnienia [17] zanotowali oni, że ci sami pacjenci z grupy badanej w jednym przypadku mają obecne przeciwciała anty-CRP, a w innym czasie przeciwciała te są niewykrywalne, co nasunęło pytanie, czy obecność przeciwciał może być różna w czasie trwania choroby i czy ma to związek z aktywnością choroby. Postanowiono zatem oznaczyć autoprzeciwciała przeciwko CRP w serii 5 surowic pochodzących od 10 chorych z toczniem układowym [12]. Mimo że badany materiał liczył zaledwie 50 próbek, zaobserwowano wiele zależności. W 4 przypadkach zauważono pozytywną korelację między stężeniem przeciwciał anty-CRP a aktywnością choroby ocenianą skalą SLEDAI, w 5 zaś między stężeniem przeciwciał anty-CRP a stężeniem przeciwciał przeciw dsDNA. Ujemną zależność otrzymano natomiast dla składowych C1q, C3, C4 dopełniacza oraz dla liczby leukocytów. W poprzednich badaniach [17] nie znaleziono związku pomiędzy poziomem autoprzeciwciał anty-CRP a mianem przeciwciał anty-dsDNA. Badacze doszukują się powodu w różnicach metodologicznych dla wykrywania przeciwciał anty-dsDNA i w różnicach w selekcji surowic pacjentów.
U chorych na TRU często obserwuje się występowanie dużych surowiczych stężeń nukleosomów [21, 22]. Ponieważ CRP łączy się z kilkoma strukturami komórkowymi [23], w tym z antygenami nukleosomów, może to być argumentem, że przeciwciała przeciwko CRP in vivo mogą wchodzić w interakcję z krążącymi nukleosomami i przeciwciałami antynukleosomowymi. Analiza korelacji wykonana przez autorów niniejszego opracowania pokazała jednak, że nie ma związku między przeciwciałami anty-CRP a przeciwciałami antynukleosomowymi. Obserwacja ta jest zgodna z wynikiem uzyskanym przez Sjöwal i wsp. [12]. Otrzymano jednak ujemną korelację między surowiczym stężeniem hsCRP u chorych na TRU względem poziomów przeciwciał antynukleosomowych. Małe stężenia surowiczego hsCRP są związane z dużymi mianami przeciwciał antynukleosomowych u chorych. Na podstawie dotychczasowych publikacji na temat występowania autoprzeciwciał anty-CRP w TRU wysunął się zarys problemów wymagający dalszego poznania.
Wnioski
Stwierdzono, że obecność autoprzeciwciał anty-CRP u chorych na TRU nie ma związku z surowiczym stężeniem hsCRP u tych chorych. Wśród pacjentów z obecnymi przeciwciałami przeciwko białku C-reaktywnemu większą aktywność choroby stwierdzono u chorych z dużym stężeniem przeciwciał, ale bez różnic istotnych statystycznie. Nie znaleziono zależności między obecnością przeciwciał anty-CRP a objawem zajęcia nerek w przebiegu tocznia układowego. Analiza korelacji wykazała brak związku między przeciwciałami anty-CRP a przeciwciałami antynukleosomowymi. Wykazano statystycznie istotną różnicę między surowiczym stężeniem hsCRP względem poziomów przeciwciał przeciw nukleosomom.

Piśmiennictwo
1. Bijl M, Limburg PC, Kahlenberg CG. New insights into the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE): the role of apoptosis. Neth J Med 2001; 59: 66-75.
2. Sjöwall C, Bengtsson T, Skogh T. CRP and anti-CRP autoantibodies in systemic lupus erythematosus. Curr Rheumatol Rev 2005; 1: 81-89.
3. Munoz LE, Gaipl US, Franz S, et al. TRU – a disease of clearance deficiency. Rheumatology (Oxford) 2005; 44: 1101-1107.
4. Volanakis JE. Human C-reactive protein: expression, structure, and function. Mol Immunol 2001; 38: 189-197.
5. Kishore U, Ghai R, Greenhough TJ, et al. Structural and functional anatomy of the globular domain of complement protein C1q. Immunol Lett 2004; 95: 113-128.
6. Mold C, Gewurz H, Du Clos TW. Regulation of complement activation by C-reactive protein. Immunopharmacology 1999; 42: 23-30.
7. Tan EM, Cohen AS, Fries JF, et al. The 1982 revised criteria for the classification of SLE. Arthritis Rheum 1982; 25: 1271-1277.
8. Rosenau BJ, Schur PH. Antibodies to C-reactive protein. Ann Rheum Dis 2006; 65: 674-676.
9. Robey FA, Jones KD, Steinberg AD. C-reactive protein mediates the solubilization of nuclear DNA by complement in vitro. J Exp Med 1985; 161: 1344-1356.
10. Bell SA, Du Clos TW, Khursigara G, et al. Autoantibodies to cryptic epitopes of C-reactive protein and other acute phase proteins in the toxic oil syndrome. J Autoimmun 1995; 8: 293-303.
11. Shoenfeld Y, Szyper-Kravitz M, Witte T, et al. Autoantibodies against protective molecules – C1q, C-reactive protein, serum amyloid P, mannose-binding lectin, and apolipoprotein A1 prevelence in Systemic Lupus Erythematosus. Ann NY Acad Sci 2007; 1108: 227-239.
12. Sjöwall C, Bengtsson A, Sturfelt G, Skogh T. Serum levels of autoantibodies against monomeric C-reactive protein are correlated with disease activity in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther 2004; 6: 87-94.
13. Kovacs A, Green F, Hansson LO, et al. A noved common single nucleotide polymorphism in the promoter region of the C-reactive protein gene associated with the plasma concentration of C-reactive protein. Atherosclerosis 2005; 178: 193-198.
14. Szalai AJ, Wu J, Lange EM, et al. Single-nucleotide polymorphisms in the C-reactive protein (CRP) gene promoter that affect transcription factor binding, alter transcriptional activity, and associate with differences in baseline serum CRP level. J Mol Med 2005; 83: 440-447.
15. Figueredo MA, Rodriguez A, Ruiz-Yagüe M, et al. Auto-antibodies against C-reactive protein: clinical associations in systemic lupus erythematosus and primary antiphospholipid syndrome. J Rheumatol 2006; 33: 1980-1986.
16. Minatani M, Shinichi A, Tetsuo S. Autoantibodies against C-reactive protein (CRP) in sera of patients with systemic rheumatic diseases. Mod Rheumatol 2001; 11: 127-131.
17. Sjöwall C, Eriksson P, Almer S, Skogh T. Autoantibodies to C-reactive protein is a common finding in SLE, but not in primary Sjögren’s syndrome, rheumatoid arthritis or inflammatory bowel disease. J Autoimmun 2002; 19: 155-160.
18. Jönsen A, Bengtsson AA, Gunnarsson I, et al. Association of polymorphic variants of FcgRIIIa and CRP genes with nephritis in SLE. Abstract, ACR San Diego, 2005.
19. Nakahara C, Kanemoto K, Saito N, et al. C-reactive protein frequently localizes in the kidney in glomerular diseases. Clin Nephrol 2001; 55: 365-370.
20. Zuniga R, Markowitz GS, Arkachaisri T, et al. Identification of IgG subclasses and C-reactive protein in lupus nephritis: the relationship between the composition of immune depositis and Fcg receptor type IIa alleles. Arthritis Rheum 2003; 48: 460-470.
21. Amoura Z, Koutouzov S, Piette JC. The role of nucleosomes in lupus. Curr Opin Rheumatol 2000; 12: 369-373.
22. Mohan C, Adams S, Stanik V, Datta SK. Nucleosome: a major immunogen for pathogenic autoantibody-inducing T cells of lupus. J Exp Med 1993; 177: 1367-1381.
23. Du Clos TW. The interaction of C-reactive protein and serum amyloid P component with nuclear antigens. Mol Biol Rep 1996; 23: 253-260.