Anaemia in inflammatory bowel disease – aetiopathogenesis, diagnosis and management

Wstęp

Nieswoiste zapalenia jelit (NZJ), w tym choroba Leśniowskiego-Crohna (ChLC) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (WZJG), mogą przebiegać z licznymi manifestacjami pozajelitowymi. Anemia stanowi najczęstsze układowe powikłanie tych chorób [1]. Częstość jej występowania waha się od 6% do 74% w zależności od przyjętej definicji oraz badanej populacji [2, 3]. Obecnie nie ma badań na skalę populacyjną, jednak przyjmuje się, że anemia dotyczy średnio ok. 30% pacjentów z NZJ. Występowanie niedokrwistości w przebiegu tych chorób wiąże się z istotnym pogorszeniem jakości życia oraz znaczącym wzrostem wskaźnika hospitalizacji [4, 5]. Utrzymująca się anemia powoduje upośledzenie funkcji serca i nerek oraz pogorszenie systemowej dystrybucji tlenu, tolerancji wysiłku i osłabienie [1, 2].

Wydaje się, że w porównaniu z innymi powikłaniami NZJ, niedokrwistości poświęcano stosunkowo mniej uwagi, traktując ją być może jako nieuniknioną i nierozerwalną manifestację chorób zapalnych jelit. W ostatnich latach natomiast podkreśla się znaczenie leczenia anemii jako istotnego elementu postępowania i jednego z głównych celów terapeutycznych w NZJ [1, 6].

Etiopatogeneza niedokrwistości w nieswoistych zapaleniach jelit

Etiopatogeneza niedokrwistości w NZJ ma charakter wieloczynnikowy (tab. I). Główną komponentę stanowi niedokrwistość z niedoboru żelaza wynikająca z przewlekłej utraty krwi (jawnej i utajonej) ze zmienionej błony śluzowej jelita, ale również z zaburzeń wchłaniania czy względów dietetycznych [8]. Drugim najistotniejszym elementem jest tzw. niedokrwistość chorób przewlekłych (anemia of chronic disease – ACD), będąca efektem niekorzystnego wpływu aktywacji kaskady reakcji immunologicznych na przebieg erytropoezy. Wykazano, że cytokiny prozapalne, takie jak interferon alfa (IFN-a), interferon gamma (IFN-), interleukina 1 (IL-1) i czynnik martwicy nowotworów alfa (TNF-), wpływają istotnie na rozwój anemii poprzez hamowanie prekursorów erytroidalnych oraz zaburzanie metabolizmu żelaza związane z jego retencją w obrębie makrofagów, a także poprzez upośledzenie jelitowego wchłaniania żelaza [9, 10]. Leczenie infliksymabem, antagonistą anty-TNF-, skutecznie odwraca ten efekt, stymulując erytropoezę [10]. W niektórych przypadkach niedokrwistość jest związana z działaniem niepożądanym leków bezpośrednio upośledzających erytropoezę (sulfasalazyna, azatiopryna, 6-merkaptopuryna, metotreksat), hemolizą czy obecnością zespołu mielodysplastycznego. Sulfasalazyna może wpływać na erytropoezę w kilku mechanizmach: poprzez zmniejszenie wchłaniania kwasu foliowego, hemolizę oraz możliwość wystąpienia aplazji szpiku [11]. Kolejnym elementem, szczególnie u chorych na ChLC, jest zaburzenie wchłaniania witaminy B12 i/lub kwasu foliowego z powodu stanu zapalnego w obrębie jelita cienkiego lub w wyniku przebytej rozległej resekcji jelita cienkiego [10, 11]. W przebiegu NZJ przyczyny niedokrwistości mogą nakładać się w różnych fazach choroby, stanowiąc w praktyce klinicznej istotne wyzwanie diagnostyczne i terapeutyczne. Najczęściej anemia związana z NZJ jest jednak kombinacją niedokrwistości z niedoboru żelaza oraz ACD.

Rozpoznanie anemii w nieswoistych zapaleniach jelit

Niedokrwistość określa się jako zmniejszenie liczby krążących krwinek czerwonych, stężenia hemoglobiny (Hb) lub hematokrytu we krwi [7]. Światowa Organizacja Zdrowia (World Health Organization – WHO) definiuje niedokrwistość jako stężenie Hb poniżej 12 g/l u kobiet nieciężarnych, poniżej 11 g/dl u kobiet w ciąży i poniżej 13 g/dl u mężczyzn. U większości chorych na NZJ występuje niedokrwistość łagodnego lub umiarkowanego stopnia (stężenie Hb > 10 g/dl). Zmniejszenie jej poziomu poniżej 10 g/dl jest uważane za ciężką nie­dokrwistość wymagającą intensywnego leczenia. W praktyce klinicznej sposób postępowania oraz moment wdrożenia leczenia zależy jednak nie tylko od stężenia hemoglobiny, ale również od względnego stopnia jej redukcji, współwystępowania innych chorób oraz obecności objawów klinicznych i ogólnego stanu chorego. Istnieje również zależność pomiędzy stopniem aktywności choroby a stopniem nasilenia niedokrwistości [12].

W celu zapewnienia odpowiedniego leczenia konieczne jest przeprowadzenie diagnostyki różnicowej pomiędzy niedokrwistością z niedoboru żelaza a ACD, a także między niedokrwistością z niedoboru żelaza z towarzyszącą ACD oraz ACD bez współistniejącej niedokrwistości z niedoboru żelaza. Ta ostatnia postać niedokrwistości występuje dość rzadko u chorych z NZJ i obserwuje się ją tylko po przeprowadzeniu intensywnej dożylnej suplementacji żelaza [13].

Rozpoznanie niedokrwistości z niedoboru żelaza zasadniczo ustala się na podstawie parametrów hematologicznych oraz wskaźników metabolizmu żelaza. W jej typowej postaci stwierdza się zmniejszone stężenie żelaza, ferrytyny oraz obniżenie wysycenia transfe­ryny przy zwiększonym stężeniu transferyny. Diagnoza anemii sideropenicznej w przebiegu NZJ na podstawie powyższych parametrów jest utrudniona z uwagi na częste współistnienie ACD oraz fakt, że stan zapalny istotnie wpływa na poziom wskaźników metabolizmu żelaza [7, 14]. Wiarygodnym parametrem różnicującym obie postaci anemii w NZJ wydaje się poziom rozpuszczalnego receptora dla transferryny, który w przypadku niskiej dostępności żelaza dla erytropoezy jest podwyższony [9, 13]. Dostępne dane na temat użyteczności tego parametru dotyczą pediatrycznych przypadków NZJ [15], ponadto możliwości jego rutynowego oznaczania są obecnie wciąż ograniczone. Sugeruje się również, że kryteria diagnostyczne niedokrwistości z niedoboru żelaza należy korygować w zależności od nasilenia stanu zapalnego. U chorych bez klinicznych i biochemicznych cech zapalenia jako małe stężenia ferrytyny przyjmuje się wartości poniżej 30 µg/l, natomiast w przypadku cech współistniejącego procesu zapalnego w międzynarodowych wytycznych za stężenie ferrytyny świadczące o niskich rezerwach żelaza zaleca się przyjmowanie wartości poniżej 100 µg/l [16].

U chorych na NZJ zaleca się przeprowadzanie badań kontrolnych pod kątem niedokrwistości co 3 mies. w ak­tywnej fazie choroby i minimum co 6 mies. w czasie remisji. Badania laboratoryjne powinny obejmować przynajmniej morfologię, stężenie ferrytyny, transferryny oraz białka C-reaktywnego, a dodatkowo w miarę potrzeby stężenie witaminy B12, kwasu foliowego, retykulocytozę.

Leczenie – doustne, dożylne, erytropoetyna

Niedokrwistość może być niekiedy niesłusznie traktowana jako nieunikniony objaw NZJ. Jednakże w każdym przypadku powinna być rozpoznawana i intensywnie leczona. Celem leczenia jest nie tylko wyrównanie stężenia hemoglobiny, ale przede wszystkim poprawa jakości życia.

W przypadku stwierdzenia ACD, o ile to możliwe, konieczne jest przede wszystkim skuteczne leczenie choroby podstawowej. Jeżeli jednak nie jest to możliwe lub anemia jest zaawansowana, należy wdrożyć postępowanie ukierunkowane na leczenie niedokrwistości. Suplementacja żelaza jest konieczna w klasycznej niedokrwistości sideropenicznej. Uzupełnienie niedoborów żelaza u pacjentów z NZJ zaleca się rozpoczynać w każdym przypadku stwierdzenia anemii, rozpoznawanej zgodnie z definicją WHO. W przypadku niedoboru żelaza bez cech niedokrwistości wg dostępnych wytycznych należy rozważyć wspólnie z pacjentem różne formy suplementacji tego pierwiastka [16]. Całkowity deficyt żelaza (total iron deficit – TID) można oszacować na podstawie wzoru Ganzoniego: TID [mg] = masa ciała [kg] × (optymalne stężenie Hb – aktualne stężenie Hb) [g/dl] × 0,24 + ilość żelaza [mg] potrzebna do odtworzenia zapasu (500 mg).

Obliczenia wg tego wzoru mogą wiązać się jednak z niedoszacowaniem niedoboru w magazynach żelaza u mężczyzn, które wynoszą ok. 700–900 mg [17].

Transfuzje krwi, mimo iż są szeroko stosowane w przypadku konieczności szybkiej korekcji niedokrwistości mogącej zagrażać życiu, nie wywołują jednak trwałego efektu oraz nie wpływają na chorobę podstawową, a wiążą się z immunizacją chorych. O przetoczeniu krwi nie powinno decydować jedynie stężenie hemoglobiny, a przede wszystkim stan kliniczny oraz obecność chorób współistniejących.

Stwierdzono, że suplementacja żelaza jest skutecznym sposobem leczenia u chorych na NZJ z towarzyszącą niedokrwistością [18]. Najwyższą skutecznością charakteryzuje się u pacjentów z anemią sideropeniczną i towarzyszącą ACD, ponieważ osoby te są zwykle całkowicie pozbawione rezerw żelaza. Głównym celem jest normalizacja stężenia hemoglobiny (> 13 g/l u mężczyzn i > 12 g/l u kobiet), ale również skuteczne uzupełnienie rezerw żelaza.

Doustne preparaty żelaza

Doustna droga podawania żelaza jest skuteczną metodą suplementacji, lecz w krótkim czasie dochodzi do przerwania terapii przez 21% pacjentów z uwagi na objawy nietolerancji [2].

Ponadto w przypadku aktywnej fazy choroby żelazo podawane doustnie słabo się wchłania w dwunastnicy ze względu na wpływ białka ostrej fazy – hepcydyny i TNF- [13]. Może również wywoływać stres oksydacyjny w obrębie zmienionego zapalnie jelita [1, 7]. Istnieją także doniesienia o wpływie doustnych preparatów żelaza na zaostrzenie procesu zapalnego oraz na proces kancerogenezy w doświadczalnych modelach chorób zapalnych jelit [19].

Doustne preparaty żelaza występują w postaci soli żelaza (siarczan, glukonian, bursztynian żelaza). Wszystkie związki żelaza ulegają utlenianiu w świetle lub w obrębie błony śluzowej jelita z uwolnieniem rodników hydroksylowych, odpowiedzialnych za takie objawy, jak nudności, biegunka, wzdęcia i ból w nadbrzuszu. U chorych na NZJ zaleca się stosowanie stosunkowo niskich dawek doustnych preparatów żelaza (50–100 mg elementarnego żelaza na dobę) ze względu na fakt, że większe dawki nie wiążą się z większą skutecznością ani lepszym jego wchłanianiem, a działania niepożądane są zależne od dawki [20].

Dożylna suplementacja żelaza

Wskazania do dożylnej suplementacji żelaza przedstawiono w tabeli II. U pacjentów z NZJ z towarzyszącą niedokrwistością stwierdza się dobrą odpowiedź na dożylną suplementację żelaza [9, 18, 20]. Ta droga podania bezpośrednio do krążenia wymaga odpowiedniej formuły preparatów, aby zapobiec toksycznemu wpływowi soli żelaza na komórki [9]. Wszystkie preparaty dożylne mają formę koloidów zawierających sferoidalne nanocząsteczki związków żelaza (Fe3+). W praktyce klinicznej najczęściej stosowanych jest kilka preparatów, różniących się budową rdzenia i otoczki cząsteczek, a co z tym związane, właściwościami farmakologicznymi i biologicznymi: cukrzan żelaza, glukonian żelaza, dekstran żelaza i żelazo w kompleksie z karboksymaltozą (tab. III) [20, 21]. W większości doniesień dotyczących dożylnej suplementacji żelaza u chorych na NZJ stosowano cukrzan żelaza, a dobrą odpowiedź na leczenie uzyskiwano u 50–91% pacjentów w zależności od przyjmowanych kryteriów [2]. W ostatnich latach opracowano nowe postacie dożylnych preparatów żelaza o znacznie mniejszym wskaźniku działań niepożądanych. Pomimo zachęcających publikacji i prób klinicznych wciąż brakuje danych o ich stosowaniu w określonych grupach chorych na NZJ [22]. Coraz większym zainteresowaniem ze względu na właściwości farmakokinetyczne oraz dotychczasowe wyniki badań klinicznych cieszy się niskocząsteczkowy dekstran żelaza oraz żelazo w kompleksie z karboksymaltozą. Stabilność kompleksów dekstranu pozwala na podawanie jednorazowo dużych dawek. Jako działanie niepożądane może wystąpić jednak reakcja anafilaktyczna na dekstran. Niekorzystną reakcją na glukonian żelaza natomiast jest zespół przesiąkania włośniczek (capillary leak syndrome) z uszkodzeniem śródbłonka będący przyczyną nudności, hipotensji, tachykardii oraz obrzęku rąk i stóp. Cukrzan żelaza jest zasadniczo uważany za bezpieczniejszy niż dekstran żelaza i charakteryzuje się dobrą tolerancją również u chorych, u których wystąpiły reakcje niepożądane na dekstran [7]. Dopuszczalne są pojedyncze dawki 100–300 mg cukrzanu żelaza, a maksymalna dawka tygodniowa wynosi 600 mg [23]. Preparat żelaza w kompleksie z karboksymaltozą może być stosowany w pojedynczej dawce 1000 mg w ciągu 15 min. Najnowsze doniesienia sugerują, że pozwala on na szybsze zwiększenie stężenia hemoglobiny, skuteczniejsze uzupełnienie zasobów żelaza oraz zapewnia lepszą tolerancję [24].

U pacjentów z NZJ i anemią z niedoboru żelaza ze stężeniem Hb powyżej 10 g/dl zaleca się początkowo uzupełnienie żelaza drogą doustną, przy stężeniach poniżej 10 g/dl korzystniejsza jest natomiast suplementacja dożylna. Zaleca się ją również przy Hb > 10 g/dl, przy nietolerancji lub nieskuteczności preparatów doustnych [1–3, 16]. Niekorzystnym zjawiskiem w przy­padku stosowania suplementacji dożylnej żelaza u cho­rych nieotrzymujących jednocześnie terapii erytropoetyną jest fakt, że duża część podawanej dawki żelaza dostaje się do układu siateczkowo-śródbłonkowego, gdzie jest ono mniej dostępne dla erytropoezy. Nie zaleca się dożylnego podawania żelaza u pacjentów z ACD z dużym lub prawidłowym stężeniem ferrytyny (powyżej 100 ng/ml) ze względu na działania niepożądane.

Leki stymulujące erytropoezę

Jak już wspomniano powyżej, niedokrwistość związana z NZJ zazwyczaj ma postać kombinacji anemii sideropenicznej i ACD. Zwiększenie stężenia cytokin prozapalnych obserwowane w przebiegu tych chorób wpływa na nieadekwatną produkcję erytropoetyny (EPO) w odniesieniu do stopnia nasilenia niedokrwistości. U chorych na NZJ opisywano większe stężenia EPO w porównaniu z populacją zdrową. Stężenie to zwiększa się wraz ze stopniem nasilenia niedokrwistości [7, 25].

W ciągu ostatnich lat ukazało się kilka badań dotyczących skuteczności EPO w leczeniu niedokrwistości związanej z NZJ [7, 25, 26]. Celem terapii EPO jest zniwelowanie negatywnego wpływu aktywacji układu immunologicznego na aktywność endogennej EPO oraz stymulacja proliferacji komórek prekursorowych układu krwiotwórczego, jednakże dokładny mechanizm działania tych leków w ACD jest wciąż słabo poznany [27]. Sugeruje się, że epoetyna może wywierać ponadto dodatkowe działanie biologiczne w zapalnych chorobach jelit, wpływając na przewodnictwo sygnałów oraz stymulując gojenie błony śluzowej jelita w zespoleniach po zabiegach operacyjnych poprzez zwiększenie liczby fibroblastów oraz przyspieszanie różnicowania nowych naczyń krwionośnych. Stwierdzono, że stosowanie EPO u szczurów z colitis indukowanym dwunitrobenzenowym kwasem sulfonowym (dinitrobenzene sulfonic acid – DNBS) zmniejsza stopień aktywności choroby [7, 28].

Czynnikami predykcyjnymi dobrej odpowiedzi na leczenie pochodnymi ludzkiej EPO i lekami stymulującymi erytropoezę jest małe stężenie transferyny i erytropoetyny w surowicy [9]. Leczenie EPO powinno być z tego względu zarezerwowane wyłącznie dla pacjentów z małym stężeniem endogennej EPO lub chorych, u których nie uzyskano efektu w wyniku dożylnej suplementacji żelaza [29]. Ponadto może stanowić uzupełnienie terapii u chorych na NZJ poddawanych agresywnemu leczeniu (w tym lekami immunosupresyjnymi) [12]. Leki stymulujące erytropoezę (epoetyna alfa, epoetyna beta, darbepoetyna alfa) mogą przynieść efekt w ACD przy wartości Hb poniżej 10 g/dl. Jednakże częstość stosowania tej formy leczenia niedokrwistości związanej z NZJ nie jest obecnie duża z uwagi na dobrą, w zdecydowanej większości przypadków (70–80%), odpowiedź na dożylną suplementację żelaza [16]. Leczenie EPO zawsze powinno być skojarzone z dożylnym podawaniem żelaza ze względu na możliwość czynnościowego niedoboru żelaza związanego z niewystarczającą dostępnością tego pierwiastka dla erytropoezy pomimo jego prawidłowych zasobów w organizmie [26, 30].

Leczenie niedokrwistości u pacjentów z NZJ stanowi istotny problem kliniczny. W jednym z ostatnich badań obserwacyjnych stwierdzono szybki nawrót niedokrwistości u pacjentów z NZJ pomimo wcześniejszego sukcesu terapeutycznego. Nawrót anemii z niedoboru żelaza wystąpił w ciągu 10 mies. u połowy chorych otrzymujących wcześniej żelazo drogą dożylną (w skojarzeniu z EPO lub bez) [31].

Dotychczas nie ma badań na szeroką skalę dotyczących wpływu leczenia niedokrwistości na poprawę przebiegu klinicznego NZJ.

Piśmiennictwo

 1. Gasche C, Lomer MC, Cavill I, et al. Iron, anemia, and inflammatory bowel diseases. Gut 2004; 53: 1190-7.  

2. Kulnigg S, Gasche C. Systematic review: managing anaemia in Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther 2006; 24: 1507-23.  

3. Wilson A, Reyes E, Ofman J. Prevalence and outcomes of anemia in inflammatory bowel disease: a systematic review of the literature. Am J Med 2004; 116 (Suppl. 7A): 44S-49S.  

4. Wells CW, Lewis S, Barton JR, et al. Effects of changes in hemoglobin level on quality of life and cognitive function in inflammatory bowel disease patients. Inflamm Bowel Dis 2006; 12: 123-30.  

5. Andrzejewska J, Talarska D, Michalak M i wsp. Jakość życia osób z chorobą Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego. Analiza porównawcza. Przegląd Gastroenterologiczny 2009; 4: 251-5.  

6. Gasche C. Anemia in IBD: the overlooked villain. Inflamm Bowel Dis 2000; 6: 142-50.  

7. Tsiolakidou G, Koutroubakis IE. Stimulating erythropoiesis in inflammatory bowel disease associated anemia. World J Gastroenterol 2007; 13: 4798-806.  

8. Semrin G, Fishman DS, Bousvaros A, et al. Impaired intestinal iron absorption in Crohn's disease correlates with disease activity and markers of inflammation. Inflamm Bowel Dis 2006; 12: 1101-6.  

9. Weiss G, Gasche C. Pathogenesis and treatment of anemia in inflammatory bowel disease. Haematologica 2010; 95: 175-8.

10. Bergamaschi G, Di Sabatino A, Albertini R, et al. Prevalence and pathogenesis of anemia in inflammatory bowel disease. Influence of anti-tumor necrosis factor-alpha treatment. Haematologica 2010; 95: 199-205.

11. Gomollón F, Gisbert JP. Anemia and inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol 2009; 15: 4659-65.

12. Cronin CC, Shanahan F. Anemia in patients with chronic inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol 2001; 96: 2296-8.

13. Theurl I, Aigner E, Theurl M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. Blood 2009; 113: 5277-86.

14. Oldenburg B, Koningsberger JC, Van Berge Henegouwen GP, et al. Iron and inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 2001; 15: 429-38.

15. Revel-Vilk S, Tamary H, Broide E, et al. Serum transferrin receptor in children and adolescents with inflammatory bowel disease. Eur J Pediatr 2000; 159: 585-9.

16. Gasche C, Berstad A, Befrits R, et al. Guidelines on the diagnosis and management of iron deficiency and anemia in inflammatory bowel diseases. Inflamm Bowel Dis 2007; 13: 1545-53.

17. Bayraktar UD, Bayraktar S. Treatment of iron deficiency anemia associated with gastrointestinal tract diseases. World J Gastroenterol 2010; 16: 2720-5.

18. Gasche C, Dejaco C, Waldhoer T, et al. Intravenous iron and erythropoietin for anemia associated with Crohn disease. A randomized, controlled trial. Ann Intern Med 1997; 126: 782-7.

19. Carrier JC, Aghdassi E, Jeejeebhoy K, et al. Exacerbation of dextran sulfate sodium-induced colitis by dietary iron supplementation: role of NF-kappaB. Int J Colorectal Dis 2006; 21: 381-7.

20. Gisbert JP, Gomollon F. Intravenous iron in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2009; 15: 4666-74.

21. Aronoff GR. Safety of intravenous iron in clinical practice: implications for anemia management protocols. J Am Soc Nephrol 2004; 15 (Suppl. 2): S99-S106.

22. Auerbach M, Ballard H, Glaspy J. Clinical update: intravenous iron for anaemia. Lancet 2007; 369: 1502-4.

23. Yee J, Besarab A. Iron sucrose: the oldest iron therapy becomes new. Am J Kidney Dis 2002; 40: 1111-21.

24. Kulnigg S, Stoinov S, Simanenkov V, et al. A novel intravenous iron formulation for treatment of anemia in inflammatory bowel disease: the ferric carboxymaltose (FERINJECT) randomized controlled trial. Am J Gastroenterol 2008; 103: 1182-92.

25. Gasche C, Reinisch W, Lochs H, et al. Anemia in Crohn's disease. Importance of inadequate erythropoietin production and iron deficiency. Dig Dis Sci 1994; 39: 1930-4.

26. Koutroubakis IE, Karmiris K, Makreas S, et al. Effectiveness of darbepoetin-alfa in combination with intravenous iron sucrose in patients with inflammatory bowel disease and refractory anaemia: a pilot study. Eur J Gastroenterol Hepatol 2006; 18: 421-5.

27. Weiss G, Goodnough LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011-23.

28. Cuzzocrea S, Mazzon E, Di Paola R, et al. Erythropoietin reduces the development of experimental inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther 2004; 311: 1272-80.

29. Sandborn W. Erythropoietin for inflammatory bowel disease anemia. Gastroenterology 1997; 112: 660-1.

30. Gasche C, Waldhoer T, Feichtenschlager T, et al. W. Prediction of response to iron sucrose in inflammatory bowel disease-associated anemia. Am J Gastroenterol 2001; 96: 2382-7.

31. Kulnigg S, Teischinger L, Dejaco C, et al. Rapid recurrence of IBD-associated anemia and iron deficiency after intravenous iron sucrose and erythropoietin treatment. Am J Gastroenterol 2009; 104: 1460-7.