eISSN: 1897-4317
ISSN: 1895-5770
Gastroenterology Review/Przegląd Gastroenterologiczny
Current issue Archive Manuscripts accepted About the journal Abstracting and indexing Subscription Contact Instructions for authors
SCImago Journal & Country Rank
6/2012
vol. 7
 
Share:
Share:
more
 
 
Original paper

Isoenzymes A and B of N-acetyl-β-D-hexosaminidase in tissue of colon cancer

Napoleon Waszkiewicz
,
Beata Zalewska-Szajda
,
Sylwia Chojnowska
,
Alina Kępka
,
Wioletta Zasadowska
,
Paweł Kołodziejczyk
,
Jacek Dadan
,
Krzysztof Zwierz
,
Jerzy Robert Ładny
,
Sławomir Dariusz Szajda

Prz Gastroenterol 2012; 7 (6): 374–378
Online publish date: 2013/01/31
Article file
- Izoenzymy A.pdf  [0.10 MB]
Get citation
ENW
EndNote
BIB
JabRef, Mendeley
RIS
Papers, Reference Manager, RefWorks, Zotero
AMA
APA
Chicago
Harvard
MLA
Vancouver
 
 

Wstęp

Prognoza dla Polski zakłada szybki wzrost zachorowalności na nowotwory jelita grubego i umieralności z ich powodu mężczyzn w wieku średnim (45–64 lata) i dojrzałym (po 65. roku życia). Wśród kobiet prognozuje się niewielki wzrost zachorowalności i dalsze ograniczenie umieralności [1]. Szacuje się, że na nowotwory jelita grubego w 2025 roku zachoruje około 15 500 mężczyzn i 9100 kobiet [1]. W ciągu najbliższych dwóch dekad liczba zgonów z powodu nowotworów jelita grubego zwiększy się prawdopodobnie w populacji mężczyzn prawie dwukrotnie (do około 10 000) i o około 1/3 w populacji kobiet (do 6400) [1].

W usuwaniu glikokoniugatów (glikolipidów, glikoprotein i proteoglikanów) tkanek zniszczonych przez nowotwór bierze udział N-acetylo-β-D-heksozoaminidaza – HEX (E.C. 3.2.1.25), najaktywniejsza kwaśna egzoglikozydaza lizosomalna odszczepiająca reszty N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) i N-acetylogalaktozoaminy (GalNAc) z nieredukcyjnego końca łańcuchów oligosacharydowych glikokoniugatów [2, 3].

Wcześniejsze badania wskazują na dużą wartość diagnostyczną oznaczenia stężenia HEX i jej izoenzymów A i B w surowicy, a także stężenia HEX oraz jej izoenzymów A i B w przeliczeniu na kreatyninę w moczu chorych na raka jelita grubego. Także oznaczanie aktywności specyficznej HEX i izoenzymu A w moczu ma wartość diagnostyczną w wykrywaniu raka jelita grubego [4].

Cel

Celem badań była ocena aktywności HEX oraz jej izoenzymów A i B w guzach nowotworowych pobranych od chorych z gruczolakorakiem jelita grubego i gruczolakorakiem śluzotwórczym jelita grubego, z uwzględnieniem typu histopatologicznego, klasyfikacji Duke’a oraz płci.

Materiał i metody

Podczas zabiegu chirurgicznego pobrano fragmenty tkanki nowotworowej o stopniu dojrzałości komórkowej G2 od 17 chorych (11 kobiet i 6 mężczyzn) w wieku 39–82 lat (średnia: 68,39 ±11,34 roku) z rozpoznanym gruczolakorakiem (n = 15) i gruczolakorakiem śluzotwórczym (n = 2) jelita grubego oraz fragmenty jelita pobranego z miejsc odległych od zmiany nowotworowej o 5 cm (granica czystości onkologicznej) (n = 15). Cztery wycięte nowotwory nie przekraczały ściany jelita (klasa A według Duke’a), 5 wyciętych nowotworów przekraczało ścianę jelita do surowicówki lub tkanki tłuszczowej okołoodbytniczej (klasa B), a 8 dało przerzuty do węzłów chłonnych (klasa C). Materiał do badań uzyskano od pacjentów leczonych w I Klinice Chirurgii Ogólnej i Endokrynologii Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku za zgodą Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku (RI-003/300/2006).

Fragmenty tkanek zawieszano w oziębionym 0,15-molowym roztworze KCl zawierającym 0,2% trytonu X-100 w stosunku wagowo-objętościowym 1 : 9 i homogenizowano za pomocą homogenizatora nożowego Ultra-turrax T8 IKA-Werke w naczyniach obłożonych lodem. Homogenaty wirowano przy 10 000 × γ w ciągu 30 min w temperaturze +4°C. Płyn nadosadowy przechowywano w temperaturze –80°C.

N-acetylo-β-D-heksozoaminidazę i jej izoenzymy A i B oznaczano metodą Marciniak i wsp. [5] w modyfikacji Szajdy i wsp. [4, 6]. Do 10 µl odpowiednio rozcieńczonego płynu nadosadowego z odwirowanego homogenatu dodawano 40 µl 0,1-molowego buforu fosforanowo-cytrynianowego o pH 4,7 i 30 µl 20-milimolowego roztworu substratu (4-nitrophenylo-N-acetylo-β-D-glukozoaminid – Sigma, St. Louis, MO, USA) w 0,1-molowym buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 4,7. Mieszaninę inkubowano 60 min w temperaturze 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 200 µl 0,2-molowego buforu boranowego o pH 9,8. W celu oznaczenia aktywności izoenzymu B do 10 µl odpowiednio rozcieńczonego płynu nadosadowego z odwirowanego homogenatu dodawano 40 µl 0,1-molowego buforu fosforanowo--cytrynianowego o pH 4,7 i preinkubowano 180 min w temperaturze 50°C w celu dezaktywacji termolabilnego izoenzymu A, a następnie dodawano 30 µl 20-milimolowego roztworu substratu i inkubowano 60 min w temperaturze 37°C. Reakcję przerywano przez dodanie 200 µl 0,2-molowego buforu boranowego o pH 9,8. Aktywność izoenzymu A obliczano z różnicy między aktywnością HEX i HEX B (HEX A = HEX – HEX B). Aktywność HEX i HEX B, odpowiadającą ilości uwolnionego p-nitrofenolu z 4-nitrofenylo-N-acetylo-β-glukozoaminidu, mierzono przy długości fali 405 nm przy użyciu czytnika płytek ELX800 i programu komputerowego KC junior (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA).

Białko w homogenatach tkanek oznaczano metodą Lowry’ego i wsp. [7]. Stężenie białka odczytywano z krzywej wzorcowej sporządzonej dla liofilizowanej albuminy (Sigma, St. Louis, MO, USA). Aktywności HEX oraz jej izoenzymów A i B wyrażono w nKat na 1 mg białka (aktywność specyficzna) i w nKat na 1 γ mokrej tkanki.



Analiza statystyczna



Do analizy statystycznej wyników testem Manna-Whitneya wykorzystano program SPSS® 8.0 for Windows PL (SPSS, Chicago, IL, USA). Korelacje badano przy użyciu testu Spearmana. Wartości p mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Badania powtarzalności (precyzji w serii) oznaczania HEX wykonano w 6 nadsączach z homogenatów tkanek kontrolnych jelita grubego (oddalonych od guza o 5 cm).

Wyniki

Współczynnik zmienności pomiarów aktywności HEX wykonanych w 6 próbkach makroskopowo niezmienionego jelita pobranych podczas operacji od pacjentów z gruczolakorakiem jelita grubego wynosił 4,69 ±0,66.

Badanie wskazuje na istotny wzrost aktywności specyficznej (nKat/1 mg białka) oraz stężenia (nKat/1 γ mokrej tkanki) HEX i jej izoenzymów A i B w tkankach gruczolakoraka jelita grubego w porównaniu z makroskopowo niezmienionymi fragmentami kontrolnymi jelita (tab. I). W porównaniu z tkanką kontrolną na podstawie klasyfikacji Duke’a stwierdzono istotnie wyższą aktywność specyficzną HEX B oraz stężenie HEX i HEX B w guzach jelita grubego klasy A, istotnie wyższą aktywność specyficzną HEX B i stężenie HEX, jej izoenzymów A i B w guzach klasy B oraz istotnie wyższą aktywność specyficzną i stężenie w klasie C (tab. II). Odnotowano także istotnie wyższą aktywność specyficzną HEX B oraz stężenie HEX i HEX B w tkance raka jelita grubego klasy A w porównaniu z klasą B. Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic między aktywnością HEX i jej izoenzymów A i B w tkankach raka jelita grubego kobiet i mężczyzn (tab. III).

Nie odnotowano istotnych zależności (korelacji) między aktywnością specyficzną HEX (r = –0,4360, p = 0,119), HEX A (r = –0,2370, p = 0,415) i HEX B (r = –0,43875, p = 0,171) oraz stężeniem HEX (r = –0,4375, p = 0,118), HEX A (r = –0,3566, p = 0,211) i HEX B (r = –0,2411, p = 0,406) a etapem rozwoju nowotworu według klasyfikacji Duke’a.

Omówienie

Rola HEX i jej izoenzymów A i B w procesie nowotworzenia nie jest dokładnie poznana. Wydaje się, że podobnie jak inne endo- [8] i egzoglikozydazy [9, 10] mogą one uczestniczyć w niszczeniu tkanki przez guz, wpływać na interakcje komórka–komórka i/lub degradację macierzy wewnątrzkomórkowej [11, 12]. Zdaniem Lewa i wsp. [13] HEX A działający na kwaśne substraty, takie jak glikozoaminoglikany i glikolipidy oraz glikoproteiny zawierające kwasy sialowe, jest mediatorem stanu zapalnego wydzielanym do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, odzwierciedla w płynach ustrojowych aktywność metaboliczną i wydzielniczą komórek. HEX B działający na obojętne łańcuchy oligosacharydowe jest wskaźnikiem uszkodzenia komórek [13].

Badania własne wskazują na istotny wzrost aktywności specyficznej i stężenia HEX, jej izoenzymów A i B w tkance gruczolakoraka jelita grubego w porównaniu z fragmentami tkanki kontrolnej (tab. I). W badaniach wykazano, że HEX B już od wczesnej fazy (klasa A według Duke’a) uczestniczy w rozwoju raka jelita grubego (tab. II). Badania własne potwierdziły wyniki Plucinsky’ego i wsp. [14], którzy nie stwierdzili zależności między aktywnością HEX i HEX B w tkance guza jelita grubego a fazą rozwoju nowotworu według klasyfikacji Duke’a. Analiza uzyskanych wyników własnych wskazuje na brak zależności między aktywnością HEX i jej izoenzymów A i B w tkance zdrowej i nowotworowej a płcią.

Wychodząc z założenia, że HEX i jej izoenzymy przechodzą do kału razem ze złuszczonymi komórkami gruczolakoraka, w badaniach własnych sugeruje się celowość przeprowadzenia prób oznaczania aktywności HEX w kale pacjentów z rakiem jelita grubego. Jeżeli uda się oznaczyć aktywność HEX i jej izoenzymów w kale i wykazać jej znamienny wzrost u pacjentów z rakiem jelita grubego, może to być podstawą opracowania metody uzupełniającej oznaczenia krwi utajonej w kale, uznawanej obecnie za badanie przesiewowe w kierunku raka jelita grubego [15].

Wnioski

Istotnie wyższa aktywność HEX i jej izoenzymów A i B w tkankach guza jelita grubego w porównaniu z tkanką jelita grubego makroskopowo niezmienioną wskazuje na wzrost katabolizmu glikokoniugatów w tkance raka jelita grubego. Wykrycie oznaczalnych aktywności HEX i jej izoenzymów w kale pacjentów z nowotworami jelita grubego może być podstawą opracowania markera użytecznego w badaniach przesiewowych w kierunku raka jelita grubego.

Piśmiennictwo

 1. Didkowska J, Wojciechowska U, Zatoński W. Prognozy zachorowalności i umieralności na nowotwory złośliwe w Polsce do 2025 roku. Centrum Onkologii Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Warszawa 2009: 23-8.

 2. Winchester B. Lysosomal metabolism of glycoproteins. Glycobiology 2005; 15: 1R-15R.

 3. Zwierz K, Zalewska A, Zoch-Zwierz W. Isoenzymes of N-acetyl-beta-hexosaminidase. Acta Biochim Polon 1999; 46: 739-51.

 4. Szajda SD, Borzym-Kluczyk M, Snarska J, et al. N-acetyl-beta-D-hexosaminidase and its isoenzymes A and B in blood serum and urine, as a potential colon cancer markers. Hepatogastroenterology 2009; 56: 1287-98.

 5. Marciniak J, Zalewska A, Popko J, Zwierz K. Optimization of an enzymatic method for the determination of lysosomal N-acetyl-beta-D-hexosaminidase and beta-glucuronidase in synovial fluid. Clin Chem Lab Med 2006; 44: 933-7.

 6. Szajda SD, Snarska J, Puchalski Z, Zwierz K. Lysosomal exoglycosidases in serum and urine of patients with colon adenocarcinoma. Hepatogastroenterology 2008; 55: 921-5.

 7. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265-75.

 8. Stypułkowska A, Zwierz P, Zwierz K. Endoglikozydazy i glikoamidazy. Post Bioch 2004; 50: 82-7.

 9. Chojnowska S, Kępka A, Szajda SD, et al. Exoglycosidase markers of diseases. Biochem Soc Trans 2011; 39: 406-9.

10. Waszkiewicz N, Szajda SD, Zalewska A, et al. Alcohol abuse and glycoconjugate metabolism. Folia Histochem Cytochem 2012; 50: 1-11.

11. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular biology of the cell. Garland Science, N.Y., 2002; 1313-62.

12. Laferte S, Loh LC. Characterization of a family of structurally related glycoproteins expressing beta1-6-branched asparagine-linked oligosaccharides in human colon carcinoma cells. Biochem J 1992; 283; 193-201.

13. Lew DB, Dempsey BK, Zhao Y, et al. Beta-hexosaminidase-induced activation of p44/42 mitogen-activated protein kinase is dependent on p21Ras and protein kinase C and mediates bovine airway smooth-muscle proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol 1999; 21: 111-8.

14. Plucinsky MC, Prorok JJ, Alhadeff JA. Beta-hexosaminidase from colon and sera of dukes-classified colorectal cancer patients: activity levels, isozyme patterns, and kinetic properties. J Natl Cancer Inst 1986; 77: 57-62.

15. Kasztelan-Szczerbińska B, Cichoż-Lach H, Słomka M. Rak jelita grubego jako problem zdrowia publicznego – ocena aktualnych możliwości diagnostycznych. Pol Arch Med Wewn 2008; 118: 1-3.
Copyright: © 2013 Termedia Sp. z o. o. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/), allowing third parties to copy and redistribute the material in any medium or format and to remix, transform, and build upon the material, provided the original work is properly cited and states its license.
Quick links
© 2019 Termedia Sp. z o.o. All rights reserved.
Developed by Bentus.
PayU - płatności internetowe