Prevalence of the N34S mutation of SPINK1 (serine protease inhibitor, Kazal type 1) in patients with chronic pancreatitis and pancreatic cancer

Wstęp

Przewlekłe zapalenie trzustki (PZT) jest chorobą charakteryzującą się nieodwracalnymi zmianami morfologicznymi w postaci postępującego uszkodzenia struktur komórkowych zewnątrzwydzielniczych i wew­nątrzwydzielniczych oraz przewodów trzustkowych, z następczym rozwojem tkanki łącznej [1–3]. Klinicznym wyrazem tych zmian są bóle w jamie brzusznej oraz postępujące upośledzenie czynności zewnątrzwydzielniczej i wewnątrzwydzielniczej.
Częstość występowania PZT ocenia się na 13–28 przypadków na 100 tys. mieszkańców [4, 5]. W krajach wysoko uprzemysłowionych najczęstszą przyczyną tego schorzenia jest nadużywanie alkoholu. Objawy choroby występują po kilkunastu latach intensywnego picia alkoholu w średniej dawce dobowej 100–150 γ (w przeliczeniu na czysty etanol).
Wśród innych czynników etiologicznych PZT wymienia się nieprawidłowości anatomiczne, tj. trzustkę dwudzielną, okołobrodawkową torbiel ściany dwunastnicy, zbliznowacenie przewodu trzustkowego oraz czynniki metaboliczne i autoimmunologiczne. U ok. 30% pacjentów chorujących na PZT nie udaje się zdefiniować czynnika etologicznego choroby i rozpoznaje się wówczas idiopatyczne PZT (PIZT) [6].
Dobrze udokumentowany jest także udział czynników genetycznych w powstawaniu PZT. W 1996 r. Whitcomb i wsp. po raz pierwszy zidentyfikowali odpowiedzialną za rozwój dziedzicznego zapalenia trzustki (DZT) mutację genu PRSS1 (PRoteaSe, Serine 1) kodującego kationowy trypsynogen [7]. Najczęściej występującą mutacją, polegającą na zastąpieniu guaniny adenozyną na 3 egzonie genu PRSS1, jest synteza kationowego trypsynogenu, w którym w pozycji 122 zamiast argininy (R) wbudowana jest histydyna (H). Zmieniony proenzym jest bardziej oporny na procesy autolizy, które w warunkach fizjologicznych odgrywają ważną rolę w regulacji aktywności trypsyny wewnątrz komórek pęcherzykowych trzustki.
W minionych kilkunastu latach ukazało się ponadto wiele publikacji wskazujących na istotną rolę trzustkowego inhibitora wydzielania trypsyny (pancreatic secretory trypsin inhibitor – PSTI, określanego również jako serine protease inhibitor, Kazal type 1 – SPINK1) w patogenezie PZT [8]. Inhibitor ten to peptyd zbudowany z 79 aminokwasów, który pozwala na unieczynnienie ok. 20% uaktywnionej wewnątrztrzustkowo trypsyny. Stanowi tym samym jedną z barier chroniących przed samostrawieniem komórek pęcherzykowych trzustki. Gen kodujący PSTI jest zlokalizowany na 5. chromosomie. Najczęstszą jego mutację określa się jako N34S. Wyniki dotychczas przeprowadzonych badań wykazały związek między obecnością mutacji w genie kodującym PSTI a występowaniem zapalenia trzustki. Witt i wsp. wykryli mutację w genie PSTI u 23% pacjentów z PIZT, natomiast Pfutzer i wsp. aż u 23 (40,35%) spośród 57 chorych z tym typem zapalenia [8, 9]. Stwierdzono również związek mutacji w genie PSTI z PZT o etiologii alkoholowej (PAZT), choć dotychczas uzyskane wyniki cechuje duża różnorodność – z częstością występowania mutacji N34S od 0% aż do 26,8% [10–12].
Przewlekłe zapalenie trzustki jest chorobą o złym rokowaniu klinicznym. Prawie połowa pacjentów z poalkoholowym PZT umiera w ciągu 20–25 lat trwania choroby [13]. Dodatkowo warto zaznaczyć, że wieloletnie PZT jest czynnikiem ryzyka rozwoju raka trzustki (RT). Dowiedziono, że po 20 latach trwania PZT ryzyko wystąpienia RT zwiększa się ponad 25-krotnie [14, 15]. Ponadto ryzyko rozwoju RT zwiększa się jeszcze bardziej w przypadku dziedzicznej postaci zapalenia, wykazano bowiem, że po kilkudziesięciu latach choroby u 40% pacjentów dochodzi do rozwoju RT [16].
Rak zewnątrzwydzielniczej części trzustki stanowi obecnie piątą przyczynę zgonów z powodu nowotworów złośliwych w społeczeństwach wysoko uprzemysłowionych [17]. Według polskich danych epidemiologicznych rocznie na RT umiera 4 tys. osób [18]. Rak tego narządu należy do nowotworów o wyjątkowo złym rokowaniu, tj. średni czas przeżycia większości chorych nie przekracza 6 mies., a odsetek przeżyć 5-letnich 3–5% [19]. Wpływa na to wiele czynników. Jednym z nich jest długi bezobjawowy okres rozwoju, a także brak wczesnych objawów patognomonicznych dla tej choroby. Mimo intensywnych badań etiologia RT pozostaje niewyjaśniona. Dotychczas wykazano, że na powstawanie tego schorzenia wpływa wiele czynników zarówno środowiskowych, jak i genetycznych. Środowiskowymi czynnikami ryzyka zachorowania na RT są przede wszystkim: palenie tytoniu, wysokotłuszczowa i wysokokaloryczna dieta, nadu­żywanie alkoholu, ekspozycja na chlorek winylu, trichloroetylen, polichlorek bifenylu, akrylamid, a także nikiel, chrom i kadm [20–22].
W 5–10% przypadków RT zostały potwierdzone predyspozycje genetyczne do rozwoju tej choroby [23, 24]. Zwiększone ryzyko wystąpienia RT obserwuje się w wielu znanych zespołach genetycznych, takich jak zespół Peutza-Jeghersa, rodzinny nietypowy wieloznamionowy zespół czerniaka (familial atypical multiple mole-melanoma – FAMMM), zespół rodzinnego raka piersi i jajnika (hereditary breast and ovarian cancer – HBOC), zespół Lyncha, rodzinna polipowatość gruczolakowata, rodzinna polipowatość młodzieńcza i zespół ataksja–telangiektazja. Ponadto u rodzin, w których wystąpiły dwa lub więcej przypadków RT wśród krewnych I stopnia, a które nie spełniają kryteriów dla żadnego innego zespołu genetycznego, rozpoznaje się rodzinnego RT (familial pancreatic cancer) [25].
Wyniki dotychczas opublikowanych badań wskazują na duże znaczenie mutacji SPINK1 w różnych typach PZT, choć jej udział w zapaleniu o etiologii alkoholowej pozostaje kontrowersyjny. Podobnie rola mutacji N34S w genie SPINK1 u chorych ze sporadycznym RT wydaje się nie do końca poznana.

Cel

Analiza częstości występowania mutacji N34S w genie SPINK1 u chorych na PZT i sporadycznego RT oraz poszukiwanie wpływu tej mutacji na przebieg kliniczny, powstanie powikłań i leczenie PZT o odmiennych etiologiach.

Materiał i metody

Do badania zakwalifikowano pacjentów chorujących na PZT i sporadycznego RT hospitalizowanych w Klinice Chorób Przewodu Pokarmowego Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego w Łodzi. Grupę kontrolną stanowiło 46 zdrowych ochotników.
Badaniami objęto 47 chorych z PZT (12 kobiet i 35 mężczyzn) w wieku między 18 lat a 66 lat (średnia wieku 44 ±7,2 roku). Rozpoznanie PZT ustalono na podstawie typowych objawów klinicznych, a także nieprawidłowości stwierdzanych w badaniach obrazowych, tj. ultrasonografii (USG) i tomografii komputerowej (TK) jamy brzusznej. Postawienie diagnozy PZT wymagało uwidocznienia następujących nieprawidłowości w badaniach obrazowych: zwapnienia miąższowe i/lub przewodowe, poszerzenia i/lub nieregularności ścian przewodu trzustkowego głównego lub przewodów drugorzędowych.
U 33 pacjentów z PZT czynnikiem etiologicznym było nadużywanie alkoholu (PAZT). Dla uznania etiologii alkoholowej PZT konieczne było potwierdzenie przez chorego spożywania alkoholu w ilości 80 g/dobę przez minimum 5 lat. Po wykluczeniu udziału czynników toksycznych, metabolicznych i zaporowych u 14 pacjentów rozpoznano PIZT. W tej grupie osób wyodrębniono młodzieńczą postać PIZT, gdy objawy choroby rozpoczęły się przed 30. rokiem życia (n = 6), natomiast u pozostałych 8 pacjentów rozpoznano późną (starczą) postać PIZT. Za początek PZT uznawano wystąpienie pierwszego epizodu ostrego zapalenia trzustki lub rozpoznanie powikłań zapalenia, tj. pseudotorbieli.
W tabeli I przedstawiono charakterystykę demograficzną chorych na PZT, z podziałem na etiologię alkoholową i idiopatyczną.
Do badania włączono ponadto 24 chorych na RT, w tym 12 mężczyzn (50%) i 12 kobiet (50%) diagnozowanych i leczonych w Klinice Chorób Przewodu Pokarmowego Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego w Łodzi. U 18 osób rozpoznanie raka ustalono na podstawie badania cytologicznego materiału uzyskanego podczas biopsji i/lub badania histologicznego materiału pozyskanego po leczeniu chirurgicznym. U pozostałych chorych diagnozę postawiono na podstawie objawów klinicznych, nieprawidłowości biochemicznych, w tym nieprawidłowych wartości CA19-9, badań obrazowych (USG, TK, ECPW, EUS) oraz losów chorych. Średni wiek chorych w chwili rozpoznania wynosił 69,1 roku. W tej grupie było 5 pacjentów w wieku 40–60 lat, grupa wiekowa 61–80 lat była najliczniejsza i obejmowała 15 osób, a w najstarszej grupie wiekowej – po 80. roku życia – znalazły się 4 osoby. Najczęstszą lokalizacją zmiany była głowa trzustki (17 chorych – 71%), u 5 osób (21%) zmiana znajdowała się w trzonie, natomiast u 2 osób (8%) zajęty był ogon trzustki. U żadnego z chorych na RT nie stwierdzono w badaniach obrazowych cech morfologicznych świadczących o współistniejącym PZT. U 1 pacjenta (4%) w wywiadzie odnotowano występowanie nowotworu złośliwego trzustki u krewnego I stopnia, w rodzinach pozostałych chorych nie stwierdzono przypadków zachorowań na nowotwór trzustki. W tabeli II przedstawiono charakterystykę demograficzną i kliniczną pacjentów z RT.
Grupę kontrolną stanowiło 46 osób zdrowych (16 ko­biet i 30 mężczyzn, średni wiek 35,0 ±17,9 roku, rozpię­tość wieku 21–77 lat).
Protokół badania został zatwierdzony przez regionalną komisję etyki.

Metodyka oznaczania mutacji N34S

Od każdego pacjenta pobierano ok. 10 ml krwi pełnej do probówki z EDTA, którą następnie przechowywano w zamrażarce w temperaturze –27°C. DNA izolowano z leukocytów krwi obwodowej, a następnie amplifikowano za pomocą starterów specyficznych dla fragmentu genu.
Mutacja N34S w genie SPINK1 była wykrywana z zastosowaniem metody reakcji łańcuchowej polimerazy – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism – PCR-RFLP).
Stosowano startery o następujących sekwencjach:
starter 1 – 5’ TTC TGT TTA ATT CCA TTTTT AGG CCA AAT GCT GCA 3’,
starter 2 – 5’ GGC TTTT ATC ATA CAA GTG ACT TCT 3’.
Mieszanina reakcyjna (25 l) obejmowała: 50 ng DNA (2 l), 0,2 µM startery (0,5 l każdego), 50 M dNTP (deoksynukleotydotrifosforany) (2,5 l), 2,5 l buforu 10 × Taq, 1 U polimerazy Taq (TaKaRa, BIOKOM) (2,5 l) i H₂O. Reakcję prowadzono w termocyklerze GeneAmp PCR system 2400; Perkin Elmer, Norwalk, USA).
Reakcja PCR obejmowała następujące etapy:
• wstępną denaturację w temperaturze 94°C (5 min),
• właściwe 35 cykli, na które składała się: denaturacja w temperaturze 94°C (30 s), hybrydyzacja ze starterami w temperaturze 60°C (30 s) i wydłużanie w temperaturze 74°C (60 s),
• końcowe wydłużanie w temperaturze 72°C (7 min).
Produkt po PCR trawiono z 1U enzymu PstI i BsrDI w objętości 25 l przez godzinę, w temperaturze 37°C dla PstI i w 55°C dla BsrDI. Analizę produktu prowadzono w 7% żelu poliakryloamidowym (PAGE). Po trawieniu PstI niezmutowany produkt odpowiadał długości 320 pz. Po trawieniu enzymem PstI produkt o długości 286 pz odpowiadał sekwencji zmutowanej (homozygota). Po trawieniu enzymem BsrDI produkt o długości 286 pz odpowiadał sekwencji niezmutowanej. Heterozygota odpowiadała pasmom 320 pz i 286 pz po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

Analiza statystyczna

Dane porównywano przy użyciu testu t-Studenta. Wyniki przeprowadzonych badań wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe. Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.

Wyniki

Częstość występowania mutacji N34S w genie SPINK1 była istotnie większa u chorych na PZT niż w grupie kontrolnej. Obecność mutacji stwierdzono u 10 pacjentów (21,3%) spośród 47 chorych na PZT, w tym 5 heterozygot i 5 homozygot, natomiast w grupie kontrolnej obecność mutacji N34S odnotowano u 3 (6,5%) spośród 46 pacjentów, w tym 2 heterozygoty i 1 homozygota.
Analizując osoby z PAZT, obecność mutacji N34S stwierdzono u 6 osób (18%), w tym 3 heterozygoty i 3 homozygoty. Nie odnotowano różnic statystycznych w częstości występowania mutacji N34S u chorych na PAZT w porównaniu z grupą kontrolną (p = 0,108, OR 3,185, 95% CI 0,745–12,606). Wykazano natomiast istotną różnicę w częstości występowania mutacji N34S u pacjentów z PIZT w porównaniu z grupą kontrolną (PIZT vs grupa kontrolna: p = 0,024, OR 5,733, 95% CI 1,218–26,959).
W kolejnym etapie wykonano analizę różnic przebiegu klinicznego PAZT i PIZT między chorymi z mutacją SPINK i osobami bez mutacji. Nie stwierdzono różnic dotyczących średniego wieku chorych na PZT w grupach z mutacją i bez mutacji. W grupach tych nie odnotowano różnic dotyczących wieku w momencie rozpoczęcia się objawów choroby. W analizie przebiegu klinicznego PZT brano pod uwagę obecność zaburzeń endokrynnych, występowanie zwapnień i zmian morfologicznych w obrębie przewodów trzustkowych. Uwzględniano także sposób postępowania terapeutycznego, w tym konieczność stałego przyjmowania narkotycznych leków przeciwbólowych, leczenie chirurgiczne i procedury endoskopowe, tj. sfinkterotomię trzustkową, żółciową, protezowanie przewodu Wirsunga i/lub przewodu żółciowego wspólnego oraz drenaż endoskopowy i/lub drenaż zewnętrzny torbieli trzustki. Nie stwierdzono różnic częstości występowania powikłań PZT w postaci torbieli rzekomych i/lub cholestazy lub zaburzeń endokrynnych w grupach w zależności od występowania mutacji. Podobnie częstość występowania zmian w badaniach obrazowych, tj. zwapnień i zmian przewodowych, nie różniła się w grupach chorych z mutacją i bez mutacji. Nie odnotowano również różnic dotyczących sposobu leczenia między badanymi grupami. Obie grupy nie różniły się także pod względem częstości palenia papierosów (tab. III i IV).
W grupie chorych na RT u 1 osoby (4%) stwierdzono mutację N34S. Nie odnotowano różnic statystycznych w częstości występowania mutacji u chorych na RT w porównaniu z grupą kontrolną (RT vs grupa kontrolna: p = 0,687, OR 0,623, 95% CI 0,085–4,696). Szczegółowe wyniki dotyczące częstości występowania mutacji N34S SPINK1 u chorych na PZT, RT i w grupie kontrolnej przedstawiono w tabeli V.

Omówienie

W badaniu własnym autorzy analizowali częstość występowania mutacji N34S trzustkowego inhibitora wydzielania trypsyny (PSTI), określanego również jako SPINK1, u chorych na PZT i raka sporadycznego tego narządu. Badaniu poddano chorych na PAZT i PIZT. Wyniki wykazały obecność mutacji u prawie 1/3 pacjentów z idiopatyczną postacią PZT i u 6 spośród 33 chorych (18%) z PZT o etiologii alkoholowej. Dane dotyczące częstości występowania tej mutacji w różnych grupach chorych na PZT są zróżnicowane. Według danych uzyskanych przez Pfutzera i wsp. dwie najbardziej znane mutacje genu SPINK1 – N34S i P55S – są częste, zwłaszcza u dzieci i osób młodocianych z PIZT [9]. Porównując natomiast częstość występowania mutacji N34S u chorych na PAZT w niniejszej pracy z wynikami innych autorów, należy stwierdzić, że w badaniu przeprowadzonym przez autorów tej publikacji częstość była zwiększona. Należy jednak zaznaczyć, że w niniejszej pracy u 3 chorych (6,5%) z grupy kontrolnej stwierdzono obecność mutacji SPINK1, co w porównaniu z innymi danymi z krajów europejskich (1–2%) stanowi również większy odsetek [8, 9, 12, 26].
Celem niniejszej pracy była także ocena wpływu mutacji SPINK1 na przebieg kliniczny PZT o odmiennych etiologiach. Analizie poddano obecność zaburzeń endokrynnych, zmian morfologicznych w trzustce, a także sposób leczenia z uwzględnieniem procedur endoskopowych i chirurgicznych. Podobnie jak w innych publikacjach, nie wykazano zależności między nasileniem objawów klinicznych, początkiem choroby a występowaniem zmutowanego genu u chorych na PAZT i PIZT [27, 28]. Nie stwierdzono również różnic w przebiegu klinicznym choroby u osób heterozygotycznych i homozygotycznych.
Chociaż związek mutacji w genie PSTI z PZT wydaje się niepodważalny, sporo kontrowersji budzi rola, jaką zmutowany peptyd może odgrywać w patogenezie choroby. Wielu autorów wskazuje, że nie jest ona decydująca. Zmutowany gen występuje w populacji znacznie częściej niż choroby zapalne trzustki. Oznacza to potencjalnie bardzo małą jego penetrację. Niektórzy badacze sugerują, że mutacja genu PSTI stanowi jedynie predyspozycję do rozwoju PZT, lecz nie jest jej bezpośrednią przyczyną. Uważają oni, że obecność zmutowanego genu PSTI ułatwia jedynie ujawnienie się choroby u osób obciążonych innymi czynnikami genetycznymi lub środowiskowymi.
Dotychczas opublikowane badania epidemiologiczne potwierdziły jednoznacznie, że długo trwające PZT jest czynnikiem ryzyka rozwoju RT [14]. Ponadto, jak wspomniano we wstępie, ryzyko wystąpienia RT jest również znaczące w wielu zespołach genetycznie uwarunkowanych nowotworów. Należy do nich m.in. FAMMM, a także HBOC [24, 29, 30]. Kolejnym rzadkim zespołem genetycznym związanym ze zwiększonym ryzykiem rozwoju nowotworu w różnych narządach, w tym predysponującym do wystąpienia RT, jest zespół ataksja–telangiektazja (AT). Należy on do grupy wrodzonych zaburzeń immunologicznych przebiegających z nadmierną łamliwością chromosomów [31]. Istnieją ponadto pojedyncze doniesienia o zwiększonym ryzyku rozwoju RT wśród pacjentów pochodzących z rodzin dotkniętych zespołem rodzinnej polipowatości gruczolakowatej (familial adematous polyposis – FAP), w zespole Peutza-Jeghersa i zespole Lyncha predysponujących do rozwoju raka jelita grubego [32–34].
Wielu autorów podkreśla także zwiększone ryzyko zachorowania na RT w przypadku częstego występowania tego nowotworu u blisko spokrewnionych członków rodziny. Badania Tersmette i wsp. wykazały, że ryzyko rozwoju RT wśród krewnych I stopnia pacjenta dotknię­tego tym nowotworem jest 18-krotnie zwiększone w rodzinach, w których wystąpiły 2 przypadki RT, i 57-kro­tnie w rodzinach, których 3 lub więcej członków dotknię­tych jest RT [35]. Dotąd jedynym genem, którego konstytucyjne zmiany zostały jednoznacznie opisane jako związane z zespołem rodzinnego RT, jest gen BRCA2 (breast cancer 2 gene).
Mimo że mutacja PRSS1 jest uznanym czynnikiem ryzyka wystąpienia RT u chorych z dziedziczną formą PZT, to jednak rola innych mutacji, których częstość w różnych typach PZT jest także zwiększona, nie jest poznana [36]. W badaniu własnym, w grupie 24 chorych na RT mutację N34S wykryto u 1 pacjenta. Pozwala to na przypuszczenie, że rozwój tego raka w populacji polskiej nie ma związku z mutacją genu SPINK1. Ze względu jednak na małą liczebność badanej grupy zagadnienie to wymaga dalszych badań. Wyniki przeprowadzonego w Finlandii badania oceniającego częstość mutacji N34S i P55S u chorych na PZT i RT potwierdziły związek mutacji N34S z PZT, ale nie wykazały, aby ta mutacja predysponowała do rozwoju RT [37]. Podobne wyniki uzyskali badacze z Włoch, analizując 61 pacjentów ze sporadycznym RT. Mutacje w genie SPINK1 stwierdzili u 5 chorych na RT (4,1%) i u 4 osób z grupy kontrolnej (2%) [38]. Przeprowadzona przez nich analiza nie wykazała także istotnego znaczenia polimorfizmów glukuronylotransferazy UGT1A7 i UGT1A9 w kancerogenezie RT. Autorzy z Niemiec analizowali częstość mutacji N34S SPINK1 u 159 chorych ze sporadycznym RT. Częstość występowania tej mutacji była nieco mniejsza niż we wcześniejszych badaniach i wynosiła 1,3% w przypadku osób z RT i 1,6% w grupie kontrolnej [39].
Udział mutacji SPINK1 w patogenezie zarówno sporadycznego RT, jak i rodzinnej postaci tej choroby analizował zespół autorów z Japonii i Stanów Zjednoczonych. Wykazali oni obecność mutacji N34S SPINK1 u 5 (2,9%) spośród 172 chorych ze sporadycznym RT, natomiast nie stwierdzono obecności tej mutacji u chorych z rodzinnym RT [40]. W innych doniesieniach z Japonii stwierdzono obecność mutacji N34S u blisko 1/3 chorych na RT, który rozwinął się na podłożu PZT [11]. Ozaki i wsp. w badaniach eksperymentalnych na liniach komórkowych RT wykazali, że białko SPINK1 może stymulować proliferację komórek RT, aktywując receptor dla EGF-R [41].
Dotychczasowe wyniki mogą sugerować, że mutacje w genie SPINK1 nie są bezpośrednio związane z rozwojem RT, ale raczej zwiększają ryzyko wystąpienia stanu zapalnego, który z kolei może zwiększać ryzyko wystąpienia tego nowotworu. Tę zależność potwierdzają coraz częściej publikowane opisy dotyczące pacjentów z przewlekłym wapniejącym zapaleniem trzustki i rakiem gruczołowym trzustki, u których stwierdzono mutację N34S SPINK1 [42]. Wydaje się jednak niezbędne poddanie dalszej obserwacji pacjentów z PZT, u których wykryto mutacje w genie SPINK1, aby jednoznacznie wykluczyć tę mutację jako czynnik predysponujący do rozwoju RT.

Piśmiennictwo

 1. Sarles H, Bernard JP, Gullo L. Pathogenesis of chronic pancreatitis. Gut 1990; 31: 629-32.  
2. Steer ML, Waxman I, Freedman S. Chronic pancreatitis. N Engl J Med 1995; 332: 1482-90.  
3. Mayerle J, Lerch MM. Is it necessary to distinguish between alcoholic and nonalcoholic chronic pancreatitis? J Gastro-enterol 2007; 42 Suppl 17: 127-30.  
4. Copenhagen pancreatitis study. An interim report from a prospective epidemiological multicentre study. Scand J Gastroenterol 1981; 16: 305-12.  
5. Lin Y, Tamakoshi A, Matsuno S, et al. Nationwide epidemiological survey of chronic pancreatitis in Japan. J Gastroenterol 2000; 35: 136-41.  
6. Etemad B, Whitcomb DC. Chronic pancreatitis: diagnosis, classification, and new genetic developments. Gastro­enterology 2001; 120: 682-707.  
7. Whitcomb DC, Gorry MC, Preston RA, et al. Hereditary pancreatitis is caused by a mutation in the cationic trypsinogen gene. Nat Genet 1996; 14: 141-5.  
8. Witt H, Luck W, Hennies HC, et al. Mutations in the gene encoding the serine pro tease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. Nat Genet 2000; 25: 213-6.  
9. Pfutzer RH, Barmada MM, Brunskill AP, et al. SPINK1/PSTI polymorphisms act as disease modifiers in familial and idiopathic chronic pancreatitis. Gastroenterology 2000; 119: 615-23.
10. Chandak GR, Idris MM, Reddy DN, et al. Absence of PRSS1 mutations and association of SPINK1 trypsin inhibitor mutations in hereditary and non-hereditary chronic pancreatitis. Gut 2004; 53: 723-8.
11. Masamune A, Kume K, Shimosegawa T. Differential roles of the SPINK1 gene mutations in alcoholic and nonalcoholic chronic pancreatitis. J Gastroenterol 2007; 42 (Suppl 17): 135-40.
12. Threadgold J, Greenhalf W, Ellis I, et al. The N34S mutation of SPINK1 (PSTI) is associated with a familial pattern of idiopathic chronic pancreatitis but does not cause the disease. Gut 2002; 50: 675-81.
13. Lowenfels AB, Maisonneuve P, Cavallini G, et al. Prognosis of chronic pancreatitis: an international multicenter study. International Pancreatitis Study Group. Am J Gastroenterol 1994; 89: 1467-71.
14. Lowenfels AB, Maisonneuve P, Cavallini G. Pancreatitis and the risk of pancreatic cancer. N Engl J Med 1993; 328: 1433-7.
15. Wong T, Howes N, Threadgold J, et al. Molecular diagnosis of early pancreatic ductal adenocarcinoma in high-risk patients. Pancreatology 2001; 1: 486-509.
16. Charnley RM. Hereditary pancreatitis. World J Gastro­enterology 2003; 9: 1-4.
17. Johnson CD, Imrie CW. Pancreatic disease. Towards the Year 2000, Springer Verlag London Limited 1999.
18. Wojciechowska U, Didkowska J, Tarkowski W i wsp. Nowotwory złośliwe w Polsce w 2004 roku. Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Warszawa 2006.
19. Jalleh RP, Williamson RCN. Pancreatic exocrine and endocrine function after operations for chronic pancreatitis. Ann Surg 1992; 216: 656-62.
20. Lowenfels AB, Maisonneuve P, Whitcomb DC, et al. Cigarette smoking as a risk factor for pancreatic cancer in patients with hereditary pancreatitis. JAMA 2001; 286: 169-70.
21. Johansen D, Borgstrom A, Lindkvist B, et al. Different markers of alkohol consumption, smoking and body mass index in relation to risk of pancreatic cancer. Pancreatology 2009; 9: 677-86.
22. Hart AR, Kennedy H, Harvey I. Pancreatic cancer: a review of the evidence on causation. Clin Gastroenterol Hepatol 2008; 6: 275-82.
23. Klein AP, Hruban RH, Brune KA, et al. Familial pancreatic cancer. Cancer J 2001; 7: 266-73.
24. Goggins M, Schutte M, Lu J, et al. Germline BRCA2 gene mutations in patients with apparently sporadic pancreatic carcinomas. Cancer Res 1996; 56: 5360-4.
25. Klein A, Brune K, Petersen G, et al. Prospective risk of pancreatic cancer in familial pancreatic cancer kindreds. Cancer Res 2004; 64: 2634-83.
26. Chen JM, Mercier B, Audrezet MP, et al. Mutations of the pancreatic secretory trypsyn inhibitor (PSTI) gene in idiopathic chronic pancreatitis. Gastroenterology 2001; 120: 1061-4.
27. Schneider A, Pfutzer RH, Barmada MM, et al. Limited contribution of the SPINK1 N34S mutation to the risk and severity of alcoholic chronic pancreatitis: a report from the United States. Dig Dis Sci 2003; 48: 1110-5.
28. Truninger K, Witt H, Kock J, et al. Mutations of the serine protease inhibitor, Kazal type 1 gene, in patients with idiopathic chronic pancreatitis. Am J Gastroenterol 2002; 97: 1133-7.
29. Easton DF, Ford D, Bishop DT. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carries. Breast Cancer Linkage Consortium. Am J Hum Genet 1995; 56: 265-71.
30. Thompson D, Easton DF. Cancer incidence in BRCA1 mutation Carries. J Natl Cancer Inst 2002; 94: 1358-65.
31. Lynch HT. Genetics and pancreatic cancer. Arch Surg 1994; 129: 266-8.
32. Watson P, Lynch HT. Extracolonic cancer in hereditary nonpolyposis colorectal cancer. Cancer 1993; 71: 677-85.
33. Spigelman AD, Farmer KCR, James M, et al. Tumours of the liver, bile duct, pancreas and duodenum in a single patient with familial adenomatous polyposis. Br J Surg 1991; 78: 979-80.
34. Su GH, Hruban RH, Bansal RK, et al. Germline and somatic mutations of the STK11/LKB1 Peutz-Jeghers gene in pancreatic and biliary cancers. Am J Pathol 1999; 154: 1835-40.
35. Tersmette AC, Petersen GM, Offerhaus GJ, et al. Increased risk of incident pancreatic cancer among first-degree relatives of patients with familial pancreatic cancer. Clin Cancer Res 2001; 7: 738-44.
36. Rebours V, Boutron-Rualt MC, Schnee M, et al. The natural history of hereditary pancreatitis: a national series. Gut 2009; 58: 97-103.
37. Lempinen M, Paju A, Kemppainen E, et al. Mutations N34S and P55S of the SPINK1 gene in patients with chronic pancreatitis or pancreatic cancer and in healthy subjects: a report from Finland. Scand J Gastroenterol 2005; 40: 225-30.
38. Piepoli A, Gentile A, Valvano MR. Lack of association between UGT1A7 , UGT1A9, ARP, SPINK1 and CFTR gene polymorphisms and pancreatic cancer in Italian patients. World J Gastroenterol 2006; 39: 6343-8.
39. Teich N, Schulz HU, Witt H, et al. N34S, a pancreatitis associated SPINK1 mutation, is not associated with sporadic pancreatic cancer. Pancreatology 2003; 3: 67-8.
40. Matsubayashi H, Fukushima N, Sato N, et al. Polymorphisms of SPINK1 N34S and CFTR in patients with sporadic and familial pancreatic cancer. Cancer Biol Ther 2003; 2: 652-5.
41. Ozaki N, Ohmuraya M, Hirota M, et al. Kazal type 1 promotes proliferation of pancreatic cancer cells through the epidermal growth factor receptor. Mol Cancer Res 2009; 7: 1572-81.
42. Masamune A, Mizutamari H, Kume K, et al. Hereditary pancreatitis as the premalignant disease: a Japanese case of pancreatic cancer involving the SPINK1 gene mutation N34S. Pancreas 2004; 28: 305-10.